Плазмиды и их роль в жизнедеятельности бактериальной клетки
Способные к автономному поддержанию в цитоплазме бактерий или существованию в интегрированном в хромосому состоянии, откуда они могут свободно выходить в цитоплазму (иногда с фрагментами хромосомы). Некоторые хромосомы могут распространяться в бактериальной популяции между ее членами. Плазмиды определяют ряд важных свойств бактерий:Являются факторами фертильности – определяют донорский фенотип клетки.Контролируют резистентность к антибиотикам, сульфаниламидам, катионам тяжелых металлов, бактериоцинам, бактериофагам, к сыворотке крови.
СодержаниеI Введение.II Основная часть.История исследования плазмид.Идентификация плазмид.Классификация плазмид.Поверхностное исключение и летальный зигозис.Несовместимость и группы несовместимости.Молекулярная и генетическая организация плазмид.Молекулярная организация плазмид.Генетическая организация факторов переноса.Генетическая организация конъюгативных плазмид.Генетическая организация неконъюгативных плазмид.Поддержание в клетках.Репликация.Распределение между клетками.Генетическая регуляция.Конъюгационный перенос.Свойства бактерий, контролируемые плазмидами.Плазмиды лекарственной устойчивости.Общая характеристика и механизмы действия.Мутации внехромосомных детерминантов резистентности.Элиминация R-плазмид.Лекарственная конверсия.Продление чувствительности к лекарствам.Плазмиды бактериоциногении.Плазмиды и патогенность бактерий.Атрибуты патогенности.Плазмиды и патогенность E. coli.Плазмиды и патогенность других бактерий.III Заключение.IV Список использовавшейся литературы.
Прикрепленные файлы: 1 файлКурсовая работа по микробиологии.docx
Передаваясь от клетки к клетке, плазмиды распространяются «эпидемически» (по выражению Fredericq) в популяции чувствительных бактерий по типу вирусных агентов. Благодаря этому свойству конъюгативные плазмиды именуются инфекционными.
Многие плазмиды, обладающие свойством самопередачи (за исключением F), в большинстве клеток донорской популяции репрессированы. Их активность регулируется системой оператор – репрессор, в которой соответствующая группа генов включается периодически в зависимости от накопления в клетке специфических субстратов, контролирующих их функции.
Эти плазмиды не содержат RTF, только различные генетические детерминанты (например r) и rep-систему.
К ним относятся такие плазмиды как, ColE1, pSE101, SuSm и тд. Наиболее изучены ColE1, CloDF13. Для них характерна кластерность генов на генной карте. Например, район, отвечающий за репликацию, включает O-пункт и детерминанты, контролирующие репликацию. К этому району примыкает отвечающий за колициногенность.
Поддержание в клетках.
Выдающееся свойство плазмид – поддержание в бактериальных клетках в определенном числе копий. Здесь важны процесс репликации и точного распределения между дочерними клетками. У F-плазмиды имеется процесс, контролируемы плазмидой в виде пары генов ccd, определяющий отсеивание клеток, утерявших плазмиду. Заключается в деструкции клеток, в которых произошла ее элиминация. Когда клетка теряет плазмиду, происходит активация продуктов генов ccd, что влечет к запуску механизма самоубийства в клетке и далее в ее потомках.
Репликация. Базовый репликон.
Репликационный цикл ДНК плазмид, как и хромо-сомной, состоит из инициации, элонгации и терминации.
При удвоении ДНК плазмид образуется ковалентно закрытые, но не сверхскрученные, молекулы, которые затем конвертируются в молекулы сверхспирализованной ДНК. Процесс элонгации непрерывен. Для завершения цикла удвоения необходимо, что бы первичная элонгационная вилка достигла терминуса, а вторая начала движение от O-пункта в противоположном направлении вплоть до терминуса.
Все, что в настоящее время известно о репликации плазмид, выяснено, в основном, в ходе изучения так называемых мини-плазмид или мини-репликонов, конструируемых с помощью рестриктаз и лигазы из нормальных плазмид или введением в геномы плазмид транспозонов, вызывающих перестройки в плазмидной ДНК.
Для репликации плазмиды минимально необходима лишь часть плазмиды – базовый репликон. Наиболее полно он изучен на примере миниплазмиды F. Он в ней состоит из ряда элементов:
О-пункт – специфическая последовательность нуклеотидов, на которой происходит инициация репликации. У некоторых плазмид несколько O-пунктов (гены ori)
Структурный ген для позитивной функции (ген rep)
Детерминанты, негативно контролирующие количество плазмид (cop)
Детерминанты, обеспечивающие, распростране-ние копий (par)
Что, касается гена rep, то предполагают, что он
Контролирует инициацию репликации. Посредством про-дукции белка rep E, связывающегося с ori.
С другой стороны, предполагается существование и другой схема, контроля копийности.
Найдено 5 прямых повторов, родственных повторам в локусе ori, формирующих локус cop. Считают, что cop конкурирует с локусом ori за связывание белка repE, который обладает авторепрессорной активностью. Предполагается, что он имеет две формы, одна из которых имеет значение в инициации репликации, вторая – в репрессии гена rep (авторепрессорная активность).
Репликация плазмиды F и всех, происходящих от нее, мини-репликонов требует участия белка, кодируемого хромосомным геном dnaA и являющегося инициатором репликации бактериальной хромосомы.
Для плазмиды F характерно наличие двух O-пунктов репликации – oriS и oriV. С oriS репликация проходит в двух противоположных направлениях, тогда как с oriV – только в одном.
У большинства остальных плазмид репликация проходит по сходным схемам, с определенными отличиями, так существенные отличия наблюдаются при репликации P-подобных плазмид.
Распределение между клетками
В процессе деления.
Система распределения существует независимо от генетических структур, контролирующих репликацию. Ее существование подтверждается идентификацией плазмидных мутаций в виде делеций района par, которые прекращают распределение плазмид между дочерними клетками, но не влияют на количество их копий в родительской клетке, т. е. не влияют на копийность.
Как показывают исследования, район par минирепликона плазмиды F имеет длину порядка 3000 нуклеотидов и содержит 2 кодирующие последовательности parA и parB, а так же parC, детерминирующий синтез плазмидной центромеры. Сходная
Структура характерна для многих плазмид. Последовательности parA и parB кодируют белки, обладающие саморегуляцией на стадии транскрипции (так как их сверхпродукция привела бы к блокированию распределения). По одной из теорий предполагается, что после репликации плазмиды белки par связываются с сайтами распределения плазмид, в результате чего образуются комплексы узнавания. Последние формируют специфические димеры, которые связываются с одним из клеточных сайтов. Когда клетки делятся, то делятся и димеры, в результате чего, плазмидные копии поступают в новую генерацию клеток.
Внешнее проявление поддержания плазмид в клетках заключается в том, что большинство или все клетки плазмидосодержащей популяции содержат плазмиды. В случае F, RI и RK2 установлено, что они кодируют летальность клеток, потерявших плазмиду, т. к. продукты соответствующих плазмидных убивают клетки, потерявшие их.
Некоторые плазмиды поддерживаются в клетках в количестве 1 – 3 копий на клетку. Они нуждаются для репликации в ДНК-полимеразеIII и их репликация проходит под строгим контролем клетки. Другие – в количестве 40–50 копий и используют ДНК-полимеразу I.
Их репликация проходит под релаксированным контролем. При делении клетки, дочерние получают не менее 1 копии плазмиды. Так как считалось, что они реплицируются на определенной стадии репликации ДНК бактерии, то, вероятно, существуют контрольные механизмы. Было предположено, что плазмиды сами регулируют свою репликацию и распределение, причем система репликации реализуется путем осуществления двух функций, одна и которых определяет среднее количество копий на клетку, а другая отзывается на изменение количества и восстанавливает его до нормы.
Еще в 60-е гг. была предложена гипотеза позитивного контроля. Предполагалось, что плазмида F несет 2 генных локуса, контролирующих процесс. Репликаторный локус (оператор репликации, репликатор) и структурный ген для синтеза диффузабельной субстанции – позитивного инициатора (эффектора) репликации. Контроль синтеза инициатора модулирует частоту инициации. Для объяснения стойкого наследования клетками плазмиды F в рамках этой модели было предположено так же, что она прикрепляется к тому сайту на клеточной мембране, к которому прикрепляется хромосома. В процессе каждого деления клетки происходит удвоение и мембранного сайта, и хромосомы и плазмидной ДНК. Оба образовавшихся комплекса расходятся в дочерние клетки.
В интегрированном в хромосому клетки хозяина состоянии, плазмида теряет самостоятельность репликации, которая теперь происходит вместе с хромосомой хозяина.
В 60-е гг. была выдвинута так же гипотеза негативного контроля. В соответствии с этой теорией было предположено существование негативно действую-щего стойкого ингибитора инициации репликации. Ингибитор кодируется геном, транскрибируемом немедленно после инициации репликации и каждое инициаторное событие сопровождается продукцией ингибитора в количестве, достаточном для подавления любой последующей инициации до момента, когда концентрация ингибитора уменьшится вдвое в связи с делением клетки.
В случае плазмиды colE1, установлено, что ингибитор – нестойкие нетранслируемые молекулы РНКI, которые негативно контролируют образование гибридов РНК-прозатравка – ДНК, т. к. связывается с молекулами прозатравки. В норме молекула РНК-прозатравки соединяется с ее ДНК-шаблоном в районе O-пункта, далее РНК-аза «плавит» прозатравку, давая начало РНК-затравке, на которую потом добавляется дезоксирибонуклотиды. Комплекс же РНКI-РНК-прозатрав-ка выключается из процесса.
Определенное влияние оказывает клетка хозяина. Многие плазмиды для репликации нуждаются в бактериальных ДНК-полимеразах. Репликация плазмиды pRSF2124 нуждается в бактериальных эндонуклеазах, контролируемых генами бактериальной хромосомы.
На количество копий плазмид оказывают влияние вид бактерий, хромосомные гены, культивирование бактерий. Например копийность плазмид pER2 в E. coli выше нежели чем в коринобактериях.
Экспериментальные данные свидетельствуют, что и в контроле распределения участвуют гены хромосомы хозяина.
Процесс контролируется опероном tra. В общем виде он представляет из себя:
Образование конъюгационных пар.
Установление специфичных клеточных контактов.
Перенос начинается с сайта oriT. Перенесенная ДНК может стойко поддерживаться в трансконъюгантах в автономном состоянии либо включаться в хромосомный репликон хозяина посредством рекомбинации.
Долгое время считалось, что конъюгация – исключительно свойство Enterobacteriaceae, однако в последние годы показана ее возможность и у других микроорганизмов. У Enterobacteriaceae и Pseudomonada-ceae конъюгационный перенос обеспечивается тем, что плазмиды контролируют синтез секс-пилей для контактов. У грамположительных бактерий не обнаружены, у некоторых из них контакты между клетками обеспечиваются транспозонами (Streptococcus), фагами (staphylococcus) или экстрахромосомными ферромонами (Enterococcus).
При формировании клеточных контактов наряду с парами образуются агрегаты, в которых насчитывают до 13 скрещивающихся клеток. Эффективность спаривания не зависит от размеров агрегатов. Большинство скрещиваемых клеток способно формировать агрегаты в течение 30 минут, что, как предполагают, — результат роста и деления клеток, установивших контакты.
Способность спариваться клеток-доноров с клетками- реципиентами определяется наличием F-пилей у доноров. Тонкий механизм участия пилей в формировании клеточных контактов не выяснен до конца. Одно из объяснений его заключается в том, что последние – структуры, объединяющие конъюгирующие клетки и представляющие из себя трубки, через которые перемещается плазмида в реципиентную клетку. Другое предположение состоит в том, что, после столкновения двух соответствующих микроорганизмов и установления между ними начального контакта, пили действуют как в качестве крючков, взаимодействуя концом с поверхностью клетки реципиента. После дотрагивания пиля втягивается назад в донорскую клетку, чем обеспечивает контакт между клетками по типу «стенка к стенке». Затем формируется конъюгационная трубка.
Что бы быть компетентной в конъюгации, клетки-реципиенты должны обладать рядом свойств:
Клеточная стенка должна иметь специфические рецепторы.
Клеточная стенка должна пропускать одноцепочечную плазмидную ДНК.
Внешние факторы оказывают большое влияние на конъюгацию бактериальных клеток (состав питатель-ной среды, температура, время культивирования, изменение pH среды: снижение pH от 7.2 до 6.2 ведет к удвоению частоты спариваний).
Плазмидный перенос состоит из ряда стадий:
Инициация ДНК плазмиды.
Разделение цепей переносимой ДНК в клетке доноре. Для этого необходима насечка «надсечка» и раскручивание макромолекулы, что обеспечивается эндонуклеазами клетки – никазами.
Перенос цепи. Он осуществляется в направлении от 5’ к 3’-концу, т. е. 3’-конец – ведущий. Перенос длится 15 – 20 минут.
Конъюгативный синтез в клетке доноре
Репликонация ДНК плазмиды в клетке-реципиете. Репликонация – конвертирование одноцепочечной ДНК плазмиды в двухцепочечную.
Репликонация осуществляется в виде 2-х процессов: синтеза комплиментарной цепи и кольцевания плазмиды. Изучение плазмид F и сol показало необходимость для конъюгационного синтеза в клетках реципиентах ДНК-полимеразы III (для синтеза цепи). ДНК-полимеразе для работы необходима затравка, которую обеспечивает либо РНК-полимераза, либо РНК-примаза.
ДНК плазмид прикрепляется ко внутренней мембране в реципиентных клетках, где она приобретает кольцевую форму после синтеза второй цепи.
Мобилизация – процесс, основу которого составляют метаболические реакции, обеспечивающие подготовку плазмиды к переносу. Мобилизация присуща как конъюгативным, так и неконъюгативным плазмидам. Конъюгативные плазмиды могут мобилизовать на перенос неконъюгативные плазмиды. Это применяется при скрещивание даже очень отдаленным видам. Еще в старых работах было показано, что мобилизация на перенос неконъюгативных плазмид резистентности конъюгативными плазмидами обычно дает трансконъюганты, в которых обе плазмиды сосуществуют физически неизменными, не ассоциированными. Однако в процессе мобилизации могут формироваться и стойкие коинтеграты. Например, исследования мобилизации конъгативных плазмид pRQ1 на перенос неконъюгативных плазмид pRQ2 в клетках S. typhimurium, показало, что она сопровождается формированием коинтеграта плазмид pRQ6. Коинтегративный характер последних был подтвержден тем, что эта плазмида имеет резистентности обеих исходных, ее перенос термозависим, как pRQ1, и она несовместима с обеими исходными.
Существуют плазмиды, которые проявляют конъюгативные свойства лишь в присутствии реципиентных клеток, синтезирующих секс-ферромоны – низкомолекулярные полипептиды. Такие плазмиды установлены в клетках некоторых штаммов E. Faecalis. Они детерминируют лекарственную резистентность, гемолизины, бактериоцины и др. Ответ донорских клеток на ферромоны — через 20-30 минут. Он заключается в синтезе белковой фибриллярной иммунологически активной субстанции – адгезина – на поверхности клеток, что обеспечивает формирование агрегатов бактерий. Разным плазмидам соответствуют разные ферромоны.