ИЗУЧЕНИЕ МЕДЬСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ ГЛУТАТИОНА — ВОЗМОЖНОСТЬ ОТКРЫТЬ УНИКАЛЬНУЮ ОСНОВУ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
Микроэлементы — это важнейшие компоненты биохимических систем, они играют важную роль в правильном функционировании организма. Одним из необходимых микроэлементов является медь. Ионы меди необходимы для правильного развития соединительных тканей и кровеносных сосудов, а недостаток может привести к задержке роста, анемии, потере аппетита, атрофии сердечной мышцы. Нужное количество меди человек может получить с продуктами питания, но это удается не всегда, поэтому медь необходимо доставлять в организм другими способами. В свободном виде ионы меди опасны, так как обладают высокой токсичностью. Поэтому необходимо связывать ионы меди в комплексы, с помощью которых доставка меди в организм будет безопасной. В отличие от некоторых других комплексообразующих реагентов глутатион, попадая в организм, не только не вызывает побочных действий, но и сам обладает полезными свойствами. Потенциал соединений меди с глутатионом заключается не только в использовании в качестве источника меди как микроэлемента, но и создание лекарственного препарата (например, противоопухолевого).
Для установления возможности использования комплексов меди с глутатионом в качестве биодобавки или лекарственного средства, нужно изучить состав этих соединений, устойчивость и выявить их физиолого-биохимические свойства.
Цель работы.
Исследование состава, устойчивости и токсичности медьсодержащих соединений глутатиона в водном растворе.
Методы исследований.
Для исследования состава использовали методы спектрофотомерии и потенциометрии, а также инверсионный вольтамперометрический и кондуктометрический анализ.
Концентрации для приготовления исходных растворов были выбраны с учётом растворимости образующихся соединений и рабочим интервалом концентраций определяемых веществ на используемых приборах. В методе спектрофотометрии использовали способ изомолярных серий [1]. Согласно соотношению Cu: GSH варианты выбраны следующие: 9:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:9. С каждого раствора сняты спектры в интервале длин волн от 190 до 250 нм на спектрофотометре ЮНИКО 2800. В ходе потенциометрического и инверсионно-вольтамперометрического определения раствор 1∙10 -5 М сульфата меди (II) титровали 0,0005 М раствором глутатиона восстановленного. При потенциометрическом определении регистрировали изменение э. д. с., а при инверсионно-вольтамперометрическом — площади пиков глутатиона на вольтамперограммах [2].
В ходе кондуктометрического определения растворы солей меди (II) (брали сульфат и нитрат) с концентрацией ионов металла в растворе 1•10 -5 , 2•10 -5 , 1•10 -4 , 1•10 -3 моль/дм 3 титровали раствором глутатиона восстановленного. Регистрировали изменение электропроводности раствора на приборе “ Cond 340 i / SFT ”.
После выявления состава, образующихся соединений, было проведено исследование токсичности некоторых растворов.
Три типа растворов, содержащих соль меди в смеси с глутатионом в соотношениях Cu : GSH равных 1:0, 1:1 и 1:4 (содержание меди во всех растворах одинаковое и равно 0,64 мг/дм 3 ) протестировали биолюминесцентным и тетразольно-топографическим методами на культуре Nostoc linckia 273 (Т = 9,5 ∙ 10 9 кл/см 3 ).
Для определения степени накопления металла культурой ЦБ в ходе контакта культуры с тестируемым раствором, был применен фракционный подход. Выделяли лиофильную, лиофобную фракции и фракцию ионов, сорбированных на поверхности клеток. Лиофильная фракция (полярные соединения) экстрагируется этанолом и метанолом, лиофобная (неполярные соединения) экстрагируется четыреххлористым углеродом и хлороформом, а фракция ионов, сорбированных на поверхности клеток — раствором ЭДТА [3]. Содержание ионов меди в исследуемых фракциях определяли методом инверсионного электрохимического анализа.
Результаты и их обсуждение.
Состав и устойчивость медьсодержащих соединений глутатиона в растворе.
Данные, полученные методом спектрофотометрии, не дали сведений о существовании соединений определенного состава, зато выявлена область соотношений, в которой наблюдается существование комплексов меди (II) и глутатиона. Соединения начинают образовываться при соотношении Cu:GSH равном 2:1. При увеличении доли глутатиона оптическая плотность, приходящаяся на образующиеся соединения, возрастает и достигает максимума при соотношении 1:6. Область длин волн, в которой возможно зафиксировать образование комплексов меди и глутатиона лежит в интервале 190—217 нм (рис. 1). К сожалению, выявить области, относящиеся к комплексам определенного состава, не удалось. Это связано с тем, что длины волн, при которых наблюдается максимум поглощения растворов индивидуальных образующихся соединений, очень близки между собой и плавно переходят друг в друга.
Рисунок 1. Влияние состава растворов и длины волны на оптическую плотность (график построен по данным, относящимся только к образующимся соединениям, не учитывает оптическую плотность, обусловленную исходными соединениями)
Методами инверсионно-вольтамперометрического (рис. 2) и потенциометрического титрования (рис. 3) найдено шесть соединений меди (II) с глутатионом, мольное соотношение в которых составляет 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6.
Рисунок 2. Кривая инверсионно-вольтамперометрического титрования 1∙10 -5 М раствора сульфата меди (II) 0,0005 М раствором восстановленного глутатиона
Рисунок 3. Кривая потенциометрического титрования 1∙10 -5 М раствора сульфата меди (II) 0,0005 М раствором восстановленного глутатиона
Рассчитаны константы устойчивости предполагаемых соединений (табл. 1).
Таблица 1.
Значения lgk комплексов меди с глутатионом различного состава