Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему: Иммуно-биохимические и морфофункциональные особенности заживления ран при применении препарата "Суперлимф"
Автореферат диссертации по медицине на тему Иммуно-биохимические и морфофункциональные особенности заживления ран при применении препарата "Суперлимф"
На правах рукописи
Пустовалова Регина Александровна
ИММУНО-БИОХИМИЧЕСКИЕ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ПРЕПАРАТА «СУПЕРЛИМФ»
14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Работа выполнена на кафедрах биологии, фундаментальной и клинической фармакологии и в клинико-диагностической лаборатории Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Росздрава
Научные руководители: доктор биологических наук, доцент
доктор медицинских наук, профессор Г.А. Базанов
доктор биологических наук, профессор Н.М. Митрохин
доктор медицинских наук, профессор K.M. Резников
ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН
Защита диссертации состоится «_»_ 2009 года в
«_» часов на заседании Диссертационного совета Д217.004.01 ОАО «ВНЦ
БАВ» (1442450, Московская обл., г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ БАВ и на сайте ВНЦ БАВ (www.vnc@dio.ru)
Автореферат разослан «_»_2009 г.
доктор биологических наук, профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Организм человека обладает мощными защитными механизмами для поддержания гомеостаза внутренней среды. Сохранение целостности кожного покрова и его быстрейшее восстановление при различных повреждениях является важным звеном этой системы. Раневой процесс сопровождается сложными морфологическими, иммунологическими и биохимическими изменениями на молекулярном, клеточном, органном и организменном уровнях, которые до конца еще не изучены [И.А. Буланкина и соавт, 2002; Г.В. Хомулло, Г.А. Базанов, 2004; Ю.К. Абаев, 2006; F. Ме-hendale, P. Martin, 2001; M. Shi et al., 2004]. Продолжается активный поиск оптимальных методов стимулирования репаративных процессов с учетом индивидуальных особенностей организма [JI.H. Сернов и соавт., 2004; В.И. Ноздрин и соавт., 2006; С.Б. Серединин, В.А. Крайнева, 2009]. Для сокращения сроков репарации используются различные фармакологические препараты, в том числе средства, корригирующие активность иммунной системы. К веществам этой фармакологической группы относятся препараты, созданные на основе цитокинов. Одним из них является комплекс природных цитокинов, получивший название «Суперлимф» [JI.E. Теплинская и соавт., 2005; А.В. Мотренко, 2009]. Однако до сих пор у соединений этого типа не вскрыты многие стороны фармакодинамики, в частности, механизм реализации регенерационных и репарационных свойств, не установлена корреляция между морфологическими изменениями и сдвигами иммуно-биохимических показателей сыворотки крови и грануляционной ткани. По-видимому, выяснение подобных взаимосвязей позволит определить как отдельные стороны механизма действия «Суперлимфа», так и эффективность вещества в различные периоды восстановления тканей, целесообразность его применения в качестве репаранта. В настоящее время в качестве базисного параметра регуляции иммунных процессов у человека рассматривают баланс Т-хелперов 1-го типа (ТЫ) и Т-хелперов 2-го типа (Th2) [D. O'Gor et al., 2003]. Установлено также, что интерлейкин-1 (IL-1), интерлекин-6 (IL-6) обладают провоспалительным действием, а интерлекин-4 (IL-4), интерлейкин-10 (IL-10) - противовоспалительным. Несмотря на большое количество исследований в этом направлении, молекулярные механизмы процессов, происходящих на местном и организменном уровнях и лежащие в основе смены фаз регенерации, остаются до конца не изученными.
В связи с изложенным представляет интерес изучение динамики цитоки-нового профиля сыворотки крови и грануляционной ткани при спонтанном течении раневого процесса и воздействии комплекса цитокинов - препарата «Суперлимф», примененного местно. Изучение уровней неоптерина, лизоци-ма, SH-групп в сыворотке крови и гомогенате грануляционной ткани в процессе
репарации раны позволит судить о функциональном состоянии различных звеньев иммунных реакций и их изменениях в ходе заживления раны.
Цель исследования: оценка влияния «Суперлимфа» на комплекс иммуно-биохимических показателей и морфофункциональных изменений, происходящих при заживлении экспериментально созданных полнослойных дефектов кожи.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи.
1. Изучить влияние «Суперлимфа» на заживление экспериментальных ран с учетом динамики изменений уровня 1Ь-2, П.-10, неоптерина, 8Н-групп и лизоцима в сыворотке крови крыс.
2. Выявить влияние «Суперлимфа» на содержание 1Ь-2,1И 0, неоптерина, БН-групп и лизоцима в гомогенате грануляционной ткани крыс в ходе заживления ран.
3. Определитьсоотношениехарактерныхизмененийиммуно-биохимических показателей грануляционной ткани раны и сыворотки крови в различные периоды репарационного процесса, происходящих под воздействием «Суперлимфа».
4. Проанализировать влияние «Суперлимфа» на степень выраженности фазы воспаления раневого процесса. Изучить влияние «Суперлимфа» на морфофункциональные особенности течения заживления ран на клеточном, тканевом и органном уровнях.
5. Выявить взаимосвязь между содержанием 1Ь-2, 1Ь-10, неоптерина, 8Н-групп, лизоцима в грануляционной ткани и морфофункциональными изменениями в заживающей ране при местном применении «Суперлимфа». Научная новизна. Впервые установлено влияние препарата «Суперлимф»
на динамику содержания 1Ь-2, 1Ь-10, неоптерина, 8Н-групп, лизоцима в сыворотке крови крыс и гомогенате грануляционной ткани, что объясняет механизм стимулирующего действия этого цитокина на фазу воспаления процесса регенерации. Впервые показано влияние препарата «Суперлимф» на морфофункциональные изменения в ходе заживления ран и их корреляцию с уровнем содержания 1Ь-2,1Ь-10, неоптерина, БН-групп, лизоцима в сыворотке крови крыс и гомогенате грануляционной ткани. Полученные количественные значения этих биохимических показателей и их динамика позволяют достоверно оценить эффективность местного применения «Суперлимфа», а также других медикаментозных и немедикаментозных способов лечения ран.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты устанавливают у раствора иммуномодулятора «Суперлимф» стимулирующий эффект при осуществлении репаративных процессов в коже и позволяют выявить пути реализации его положительного воздействия. Выявленное снижение содержания восстановленных тиоловых групп и неоптерина, увеличение уровня 1Ь-2, сопровождающие ускорение заживления ран, могут быть показателями
характеристики действия «Суперлимфа» и служить обоснованием выбора наиболее эффективного режима использования препаратов цитокинового ряда в качестве стимуляторов репарации полнослойных дефектов кожи. Материалы экспериментальных исследований могут быть использованы при поиске генетических факторов, определяющих секрецию цитокинов и экспрессию рецепторов к ним. Результаты проделанной работы дают основание оптимизировать методические подходы выявления у биологически активных веществ способности к стимуляции репаративных процессов. Основные положения, выносимые на защиту:
1. Местные аппликации раствора «Суперлимф» ускоряют заживление ран на 2,0 ± 0,5 дня.
2. Применение «Суперлимфа» изменяет цитокиновый спектр и иммуно-биохимические параметры (содержание неоптерина, лизоцима, суль-фгидрильных групп) регенерирующих тканей, оптимизируя тем самым пролиферативные процессы в месте повреждения при сохранении последовательности течения этапов посттравматической регенерации тканей кожи, но сокращая сроки их осуществления.
3. Препарат «Суперлимф» обладает модулирующим действием на воспалительный этап раневого процесса.
Апробация работы. Материалы и основные результаты работы доложены и обсуждены на V Российской научной конференции (Уфа, 2007); IX Конгрессе международной ассоциации морфологов (Бухара, 2008); международной конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» (Тюмень, 2008); на совместных заседаниях кафедр фундаментальной и клинической фармакологии и биологии ГОУ ВПО Тверская ГМА (Тверь, 2008, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано шесть научных работ, в том числе три - в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста. Состоит из следующих разделов: общей характеристики работы, обзора литературы, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 21 рисунком, в том числе 6 микрофотографиями, содержит 15 таблиц. Библиографический указатель включает 330 источников (206 - отечественных и 124 - иностранных).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом исследования является препарат «Суперлимф», представляющий собой стандартизованный естественный комплекс природных иммуно-
пептидов, содержащий 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-6, фактор ингибирующий миграцию фагоцитов, фактор некроза опухоли, трансформирующий фактор роста, секретируемых лейкоцитами периферической крови свиньи. «Суперлимф» изготовлен ООО «Центр иммунотерапии «Иммунохелп», регистрационное удостоверение № РМ002447/01-2003, выданное министерством здравоохранения РФ от 12.05.2003. Комплекс природных цитокинов предназначен для местного и наружного применения. Препарат выпускается в стерильном лиофилизированном виде в ампулах, содержащих 0,1 мг активного вещества и 5 мг стабилизатора полиглюкина. Перед применением лиофилизат растворяли в 2 мл изотонического раствора хлорида натрия для инъекций.
Оценка «Суперлимфа», направленная на анализ его репаративных эффектов, проводились на модели заживления послойных «вырезанных» ран кожи у крыс. Работа выполнена на 180 белых нелинейных крысах-самцах массой 170-200 г. Все манипуляции, причиняющие боль животным, проводились под эфирным наркозом. На спине в межлопаточной области тела крыс удалялся волосяной покров. На операционное поле, обработанное 70° спиртом, прикладывался смоченный 5% спиртовым раствором йода трафарет квадратной формы, площадью 225 мм2. По границе отпечатка остроконечными ножницами вырезали лоскут кожи вместе с подкожной жировой клетчаткой. Заживление происходило открытым способом.
В ходе эксперимента было выделено три серии: 1) интактная - 5 животных - исследовали сыворотку крови неоперированных крыс; 2) контрольная — 85 животных - на рану животным один раз в сутки в утренние часы в течение 5 дней наносили одну каплю изотонического раствора хлорида натрия; 3) опытная - 90 животных - на раневое поле ежедневно наносили аппликации раствора «Суперлимф» по схеме: одна капля один раз в день в течение 5 дней, первая аппликация лекарственного вещества наносилась непосредственно после операции.
Исследовалось изменение иммуно-биохимических показателей (концентрации неоптерина, лизоцима, БН-групп, 1Ь-2 и 1Ь-10) в сыворотке крови и супернатанте грануляционной ткани животных. Биопсия грануляционной ткани и забор крови из бедренной артерии осуществлялась на 5-е, 10-е и 15-е сутки после операции с учетом литературных данных об этапности течения раневого процесса [Г.В. Хомулло и соавт., 1996; Г.В. Хомулло, Г.А. Базанов, 2004].
Сыворотку получали путем центрифугирования в течение 10 мин при 1500 об/мин свернувшейся крови, которую забирали из бедренной артерии в объеме 4-5 мл в сухие чистые пробирки. Сыворотку отбирали и хранили при температуре -40 "С. Исследование проб всех экспериментов проводилось одновременно.
Для получения супернатанта гомогената грануляционной ткани у животных после эвтаназии под эфирным наркозом иссекали кусочки ткани в области
раневого дефекта. Грануляционную ткань очищали от струпа и окружающей неповрежденной кожи, взвешивали на торзионных весах. Измельчали в ступке со стеклом, переносили в сухую чистую пробирку и добавляли стерильный изотонический раствор хлорида натрия, равный по объему массе навески грануляционной ткани. Хранили пробы при температуре -40 °С. Перед исследованием пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин. Исследование проб супернатанта грануляционной ткани проводилось одновременно с исследованием сыворотки крови.
Концентрацию SH-групп определяли фотометрическим методом с использованием реактива Эллмана [G.L. Ellman, 1959] на полуавтоматическом биохимическом анализаторе марки Screen Master фирмы Hospitex Diagnostics (Италия).
Уровень содержания цитокинов IL-2 и IL-10 исследовали на микропланшетном мультидетекторе Zenyt 1100 фирмы Antos (Австрия) по методике и с использованием наборов реактивов для иммуноферментного анализа «ИФА IL-2» и «ИФА IL-10» производства ООО «Цитокин» НИИ особо чистых препаратов, г. Санкт-Петербург.
Концентрацию неоптерина в сыворотке крови и супернатанте грануляционной ткани определяли на микропланшетном мультидетекторе Zenyth 1100 фирмы Anthos (Австрия), использовали наборы реактивов «Neopterin ELISA» фирмы «IBL» (Германия) по методике, описанной в инструкции.
Количество лизоцима (муромидазы) оценивали фотометрическим способом на полуавтоматическом биохимическом анализаторе марки Screen Master фирмы Hospitex Diagnostics (Италия) при длине волны 512 нм.
Цитологический анализ раневого отделяемого на стадии экссудации репаративного процесса проводился с использованием методики М.П. Покровской и М.С. Макарова. От каждой крысы получали по 3 мазка-отпечатка с поверхности раны на предметное стекло через 6,12 и 24 ч после нанесения ран кожи. Мазки фиксировались метиленовым синим по Май-Грюнвальду и окрашивались азур-эозином по методике Романовского. Цитограммы изучались под световым микроскопом «Olympus» производства Австрия при увеличении х 1000. При анализе цитограмм оценивалось количество, размеры ядер и сроки появления нейтрофилов и макрофагов - клеточных элементов, принимающих наиболее активное участие в раневом процессе. Диаметр ядер этих клеток определялся с помощью сетки окулярного микрометра.
Для анализа микроструктурных изменений, происходящих в процессе регенерации кожного покрова, использовали метод гистологического исследования. Биоптаты краев раны забирали через 5,10 и 15 суток после нанесения кожных повреждений. После гистологической обработки из них изготавливали срезы, толщиной 6,5 ± 0,5 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином и изучали под световым микроскопом. С помощью сетки окулярного микрометра определялась величина новообразованных структур регенерирующей
раны: высота струпа, лейкоцитарного вала, толщина грануляционной ткани и эпителиального регенерата, его протяженность.
Полученные данные обработаны методом вариационной статистики на компьютере с использованием пакета программ Microsoft Office и Mathcad 14 для операционной системы Windows. Статистическая достоверность различий средних величин определялась по t-критерию Стьюдента. В качестве индикатора достоверности принимали значение р < 0,05 [С.Н. Лапач, А.В. Чубенко, П.Н. Бабич, 2002; А. Петри, 2003].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Оценка влияния «Суперлимфа» на репаративный процесс по морфофункциональным особенностям заживающей раны
Анализ собственных данных позволил установить, что местная аппликация препарата «Суперлимф» сразу после повреждения стимулирует регенерационный процесс с первых часов после повреждения кожи крыс. В нашем эксперименте уже с первых часов наблюдения (6 и 12 ч) у животных, получавших цитокиновую иммуномодулирующую терапию, в мазках-отпечатках нейтрофилов было больше, соответственно, в 2,4 и 3,0 раза, чем у крыс, получавших 0,9% раствор NaCl. После воздействия «Суперлимфа» усиливалась фагоцитарная активность нейтрофилов. Уже по прошествии 12 ч после операции в раневом отделяемом у животных, которым назначались аппликации «Суперлимфа», абсолютное большинство бактерий находилось внутриклеточно, а через 24 ч раневое поле было свободно от микроорганизмов. В то время как у крыс, получавших изотонический раствор хлорида натрия, элиминация микробов происходила медленнее: через 12 ч после нанесения травмы соотношение внутри - и внеклеточно расположенных кокков было близко к единице, а через 24 ч еще наблюдался незавершенный фагоцитоз.
Известно, что функционально активные нейтрофилы секретируют медиаторы, которые способствуют проникновению в очаг повреждения клеток макрофагального ряда. Через 6 часов после нанесения повреждения в раневом экссудате крыс с иммуностимулирующей терапией мы обнаружили клетки системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), через 12 ч клетки СМФ имели признаки функциональной активности - крупные размеры ядер, множество пищеварительных вакуолей в цитоплазме (рис. 1). Аналогичные изменения в цитограммах при стимулировании регенераторных процессов наблюдали C.B. Зиновьев (2002); Ф.А. Каюмов (2002); G.P. Downey (1994); F. Mehendale, P. Martin (2001 ). Таким образом, «Суперлимф» усиливает адгезию нейтрофиль-
ных гранулоцитов и моноцитов к эндотелию путем увеличения экспрессии адгезионных молекул 1САМ-1 и УСАМ-1 с последующим выходом этих клеток из сосудистого русла в очаг повреждения. У крыс с аппликациями изотонического раствора №С1 первые макрофаги появились в ране лишь через 12 ч после операции.
К концу первых суток у крыс опытной серии наблюдалось снижение активности воспалительной реакции, об этом свидетельствовало уменьшение количества нейтрофильных гранулоцитов. При этом в мазках-отпечатках мы находили по 2-3 нейтрофила в препарате на стадии апоптоза (рис. 2), тогда, как у животных без лечения (контрольная серия)-один на 3-5 препаратов, [В.И. Про-хоренков и соавт., 2005; О.Б. Жукова, 2006; С. Епгк^ег й а. 2001].
Рис. 1. Крупные макрофаги с вакуолизи-рованной цитоплазмой через 12 ч после операции. «Суперлимф». Окраска по Романовскому-Гимза. *1000
Рис. 2. Клетка апоптоза через 24 ч после операции. «Суперлимф». Окраска по Романовскому-Гимза. х 1000
И.И. Долгушин (2001), О.Н. Злакоманова (2008) пришли к выводу, что провоспалительные цитокины способствуют антибактериальной защите организма. Наши данные косвенно совпадают с выводами цитируемых авторов. Известно, что Т1Ч Р-а, IЬ-1 и 1Ь-6 вызывают ряд морфологических изменений, которые приводят к увеличенной миграции лейкоцитов и притоку плазмы к поврежденному участку [Е.С. Крутиков, И.И. Топчий, 2007, 2009].
Таким образом, влияние «Суперлимфа» на первую фазу репаративного процесса заключается в оптимизации течения воспалительной реакции, делая ее более интенсивной с первых часов, но ограничивая продолжительность.
Иммунная терапия «Суперлимфом» приводила к стереотипным структурным изменениям в области повреждения. Через 5 дней от момента операции у крыс, получавших иммуномодулятор в виде аппликаций, раны были покрыты струпом достоверно более тонким, чем в контроле.
К этому времени грануляционная ткань выполняла практически всю раневую область, ее толщина составляла 922,2 ± 40,8 мкм против 540,8 ±
42,2 мкм у животных контрольной серии (табл. 1). И если при аппликациях изотонического раствора хлорида натрия наблюдалась гиперплазия пограничного эпителия, то под влиянием «Суперлимфа» начиналась активная эпителизации раны (рис. 3 и 4).
Величина различных структур заживающих ран через 5 дней после операции (мкм; М ± т)
казател и Серия Лейкоцитарный вал Грануляционная ткань Протяженность регенерата
Контроль (0,9% раствор NaCl) 95,6 Jt 15,1 540,8 ± 422 352,3 ± 29,3
Опыт («Суперлимф») 68,2 ± 14,1 922,2 ± 40,8* 623,4 ± 46,9*
Примечание. * - различия с контрольной серией достоверны при р < 0,05.
Рис. 3. Начало формирования эпителиального клина. 0,9% раствор №С1. 5-й день. Гематоксилин-эозин. ><100
Рис. 4. Протяженный эпителиальный регенерат. «Суперлимф». 5-й день. Гематоксилин-эозин. х100
Формирующийся эпителиальный клин на границе с неповрежденной кожей имел значительную протяженность. Указанное стимулирующее действие комплекса цитокинов сохранялось и на 10-е сутки эксперимента (табл. 2).
Величина различных структур заживающих ран через 10 дней после операции (мкм; М ± ш)
. Показатели Серия Лейкоцитарный вал Грануляционная ткань Протяженность регенерата
Контроль (0,9% раствор NaCl) 51,2 ± 7,2 839,7 ± 43,2 626,3 ± 37,0
Опыт («Суперлимф») 21,2 ±6,5* 1231,3 ±65,1* 980,7 ± 42,6*
Примечание. * - различия с контрольной серией достоверны при р < 0,05.
Рис. 5. Гистиоциты и неоангиогенез в грануляционной ткани. Аппликации «Суперлимфа». 10-й день. Гематоксилин-эозин. х500
Отличительной особенностью грануляционной ткани животных, получавших «Суперлимф», является мощное развитие сосудов и быстрое заполнение их кровью (рис. 5).
Стимуляторами ангиогенеза являются, среди прочих, такие цитокины, как FGF, PDGF, TGF-a и -ß, TNF-a, которые содержатся в «Суперлимфе» [A.A. Фильченков, 2007]. Именно этими причинами, очевидно, можно объяснить отсутствие сильного отека окружающих рану тканей. По
мнению М. Masuya et al. (2003), С. Fathke et al. (2004), D.C. Hess et al. (2004) часть фиброцитов в ране имеет гемопоэтическое происхождение. Превращение фиброцитов в фибробласты происходит в процессе заживления раны, в результате чего клетки начинают синтезировать такие белки внеклеточного матрикса, как коллагены I и III и виментин, необходимые для миграции собственно фибробластов и кератиноцитов кожи. Это обстоятельство создает благоприятные условия для активизации процессов пролиферации.
Завершающим этапом изучения заживления ран кожи явилось исследование биоптатов через 15 суток после операции. У животных с аппликациями 0,9% раствора NaCI раны еще покрыты струпом, под которым уже выявляется соединение эпителиальных клиньев противоположных краев раны. Сохраняется еще грануляционная ткань, в которой определяются сосуды, фибробласты не имеют четкой горизонтальной ориентации (рис. 6).
В этот же период исследования под влиянием аппликаций «Суперлимфа» происходит полная эпителизация бывшего дефекта (рис 7). Область раны
Рис. 6. Неполная эпителизация раны с очагами грануляционной ткани. 0.9% раствор МаС1. 15-й день. Гематоксилин-эозин. х]00
Рис. 7. Полная эпителизация раны. Выросты эпителия, в которых формируются придатки кожи. Аппликации «Суперлимфа». 15-й день. Гематоксилин-эозин. х100
выполнена рубцом, который представляет собой соединительную ткань, более зрелую, чем в контрольной серии. Из клеточных элементов в ней присутствуют фибробласты, гистиоциты, макрофаги.
Специфичные изменения тканей регенерата под влиянием «Суперлимфа» в результате привели к сокращению сроков заживления ран на 2,0 ± 0,5 дня по сравнению с контрольной серией (рис. 8).
Рис. 8. Изменения площади ран на последовательных этапах заживления
2. Иммуно-биохимические изменения в грануляционной ткани ран и сыворотке крови после местных аппликаций «Суперлимфа»
Под воздействием «Суперлимфа» помимо морфофункциональных проявлений, происходивших на месте нанесения раны, были выявлены изменения иммуно-биохимических показателей не только в области повреждения, но и в организме в целом. Так, у крыс с применением комплекса цитокинов в грануляционной ткани на 5-е и 10-е сутки после операции содержание БН-групп было соответственно в 1,5 и 1,3 раза ниже, чем у животных с аппликацией на рану 0,9% раствора №С1 (рис. 9).
Однако в сыворотке крови, т. е. на организменном уровне, содержание восстановленных тиоловых групп у животных с иммуномодулирующей терапией «Суперлимфом» оставалось более высоким, чем у крыс без лечения. В частности, в сыворотке крови содержание БН-групп превышало в 1,2 и 1,3 раза на 5-е и 15-е сутки наблюдения соответственно показатели контроля (рис. 10).
На 15-е сутки репаративного процесса у животных с аппликациями «Суперлимфа» исследование не проводилось, так как рубцовая ткань полностью