М.А. Титок ПЛАЗМИДЫ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
2 УДК 575: М.А. Титок Плазмиды грамположительных бактерий. Мн.: БГУ, ISBN XXX-X. Монография посвящена рассмотрению вопросов, касающихся основных механизмов копирования плазмид грамположительных бактерий и возможности их использования при изучении репликативного аппарата клетки-хозяина, а также для создания на их основе векторов для молекулярного клонирования. Работа включает результаты исследований плазмид грамположительных бактерий, проводимых в лабораториях мира, а также экспериментальный материал, полученный автором. Отсутствие в отечественной литературе обзорных работ по данной теме, а также оригинальность представленных экспериментальных данных вызовут интерес к данной монографии специалистов в области генетики микроорганизмов и молекулярной биологии. Табл. 11. Ил. 30. Библиогр.: 324 назв. Научный консультант доктор медицинских наук, профессор Ю.К. Фомичев Рецензенты доктор биологических наук, профессор В.А. Прокулевич, кандидат биологических наук, доцент В.В. Лысак ISBN XXX-X М.А. Титок,
3 Научное издание Титок Марина Алексеевна Плазмиды грамположительных бактерий Редактор Технический редактор Корректор Компьютерная верстка М.А. Титок Подписано в печать. Формат 60х84/16. Бумага офсетная Печать офсетная. Усл.печ.л. Уч.-изд.л. Тираж 50 экз. Зак. Белорусский государственный университет. Лицензия ЛВ 315 от , Минск, пр. Ф. Скорины, 4. Отпечатано в Издательском центре БГУ , Минск, ул. Красноармейская, 6. 3
4 Оглавление стр. Список сокращений. 5 ВВЕДЕНИЕ. 6 I. RCR-ПЛАЗМИДЫ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ Модель репликации RCR-плазмид Классификация RCR-плазмид Функциональная организация плазмид RCR-типа Особенности организации dso-сайтов инициации репликации ведущей нити ДНК Характеристика Rep-белков Rep-белки семейства pt Rep-белки плазмид семейства pc Rep-белки плазмид семейства pмv158/pe Инициация и терминация синтеза ведущей нити плазмидной ДНК Особенности организации и функционирования sso-сайта Регуляция репликации плазмид RCR-типа Регуляция синтеза белка инициации репликации Регуляция активности Rep-белка II. ПЛАЗМИДЫ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ТЕТА-ТИПА Классификация плазмид тета-типа Организация систем репликации плазмид тета-типа Организация систем инициации репликации плазмид семейства pwv Организация систем инициации репликации плазмид семейства pbs Организация систем репликации плазмид семейства pad Организация систем инициации репликации плазмид семейства pamβ Организация систем репликации плазмид семейства pls20 75 III. РОЛЬ РЕПЛИКАТИВНОГО КОМПЛЕКСА ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В НАСЛЕДОВАНИИ ПЛАЗМИД IV. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЛАЗМИД ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРОВ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ Литература Приложение
5 Список сокращений Плазмиды RCR-типа внехромосомные генетические элементы, репликация которых осуществляется в соответствии с механизмом «катящегося кольца» (rolling circle replication или RCR-тип репликации). Отличительной особенностью является образование при репликации промежуточных структур, напоминающих греческую букву сигма (σ). Плазмиды тета-типа - внехромосомные генетические элементы, при репликации которых образуются промежуточные структуры, напоминающие греческую букву тета (θ). dso сайт определённая последовательность в двунитевой молекуле плазмидной ДНК (double-strand origin), с которой начинается синтез ведущей нити. sso сайт определённая последовательность в однонитевой молекуле плазмидной ДНК(single strand origin), с которой начинается синтез запаздывающей нити. ssднк - фракция однонитевой ДНК, образующаяся при репликации плазмид, копирующихся в соответствии с механизмом «катящегося кольца». Rep белки - необходимые для инициации репликации внехромосомных генетических элементов белки, синтез которых определяется плазмидными генами. oriv - определенный сайт в геноме плазмиды, в котором начинается репликация ДНК HTH мотиф - определённая аминокислоная последовательность в молекуле белка, обеспечивающая взаимодействие с молекулой ДНК LZ мотиф - определённая аминокислоная последовательность в молекуле белка, необходимая для образования её димерных форм за счёт белок-белковых взаимодействий 5
6 ВВЕДЕНИЕ Плазмиды, являясь необязательными структурами бактерий, могут включать генетические детерминанты, обеспечивающие в ряде случаев селективное преимущество, содержащим их клеткам. В частности, внехромосомные генетические элементы способны обеспечивать устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов, ультрафиолетовому облучению, определять продукцию токсинов, антибиотиков, бактериоцинов, содержать гены общего клеточного метаболизма, функции систем рестрикции и модификации, деградации органических и неорганических соединений, детерминировать признаки вирулентности, фиксации азота, и многие другие свойства бактерий. Вышеперечисленные особенности являются причиной широкого распространения плазмидсодержащих бактерий в природной среде обитания, принося ощутимый вред или пользу в сфере практической деятельности человека. Такие признаки как вирулентность, устойчивость к антибиотикам создают порой серьёзные проблемы в области медицины и сельского хозяйства, в тоже время способность деградировать многие вещества природного и антропогенного происхождения, продуцировать биологически активные соединения могут быть использованы для решения проблем очистки окружающей среды от загрязнений и создания эффективных экологически безопасных технологий. Многие наследственные детерминанты плазмид представлены мобильными генетическими элементами, обладающими способностью перемещаться в клетке из одного репликона в другой, вызывая изменения экспрессии и регуляции генетических локусов, а также, обеспечивая появление новых признаков. Благодаря указанным свойствам, а также способности стабильно наследоваться при передаче в клетки бактерий различных таксономических групп (путём конъюгации, трансформации, трансдукции), плазмиды, привнося новую генетическую информацию, служат неиссякаемым источником изменчивости многих прокариотических организмов. Плазмиды являются эффективным инструментом при решении важных задач фундаментальной биологии. В частности, для создания систем генетического анализа прокариотических организмов (в качестве хромосоммобилизирующих факторов, векторов для транспозонного мутагенеза и молекулярного клонирования), изучения процессов наследования и реализации генетической информации (процессов репликации, репарации, рекомбинации, транскрипции и трансляции ДНК) и др. Изучение организации генома прокариотических организмов предполагает комплексное исследование всех генетических детерминант, 6
7 в том числе и внехромосомных генетических элементов, являющихся частью генетического аппарата и определяющих важнейшие этапы жизнедеятельности бактериальной клетки. В этом плане определенный интерес представляют грамположительные бактерии, способные вызывать различные заболевания человека и животных, осуществлять процессы брожения, используемые в промышленных производствах, утилизировать широкий спектр органических и неорганических веществ, продуцировать различные ферменты, антибиотики, стимуляторы роста растений и т.д. В настоящее время наиболее изученными из них являются бактерии Bacillus subtilis, для которых установлена полная нуклеотидная последовательность генома, что позволяет сравнивать их генетический аппарат с геномом хорошо известных грамотрицательных микроорганизмов (например, Escherichia coli) и создает предпосылки для детального изучения регуляции экспрессии прокариотических генов, а также позволяет конструировать штаммы с заданными свойствами для практического использования. Особенности, выявленные в организации генетического аппарата бактерий B. subtilis имеют существенное теоретическое и прикладное значение и позволяют рассматривать их в качестве перспективных объектов генетической инженерии, способных заменить классические бактерии E. coli. Изучение плазмид грамположительных бактерий, начавшееся в 60-х годах прошлого века позволило установить, что их репликация осуществляется двумя фундаментально различающимися механизмам: по механизму «катящегося кольца» или «разматывающегося рулона» (rolling circle replication или RCR-тип репликации) и по механизму тетатипа. Название типов репликации весьма условно и основывается на внешнем виде структур, формирующихся в процессе копирования, которые напоминают греческие буквы σ и θ, соответственно и, которые выявляются при электронной микроскопии и двухмерном электрофорезе. Следует отметить, что механизм репликации плазмид по типу «разматывающегося рулона» сходен с таковым бактериофагов, содержащих однонитевую ДНК. В то же время механизм репликации тета-типа характерен для всех без исключения хромосомальных геномов и, следовательно, плазмиды, реплицирующиеся по данному типу, напоминают бактериальные хромосомы. Следует отметить, что именно плазмидные репликоны тета-типа характеризуются большим разнообразием систем репликации, причём многие из них выявляются только в клетках грамотрицательных или только грамположительных бактерий. Лишь репликация одной группы плазмид грамположительных 7
8 бактерий (плазмиды pwv02 семейства) характеризуется сходством репликации с внехромосомными элементами грамотрицательных микроорганизмов. Целью представляемой работы является рассмотрение основных механизмов копирования плазмид грамположительных бактерий и возможности их использования при изучении репликативного аппарата клетки-хозяина, а также для создания на их основе векторов для молекулярного клонирования. Поскольку в отечественной литературе отсутствуют обзорные работы такого плана, представлялось необходимым остановиться на основных результатах исследований плазмид грамположительных бактерий, проводимых в лабораториях мира, а также включить экспериментальный материал, полученный автором в последние годы и касающийся плазмид природных штаммов B. subtilis, выделенных из различных природных источников на территории Беларуси. Автор выражает глубокую признательность Ю. К. Фомичёву, В. А. Прокулевичу, А. А. Прозорову, А. Н. Евтушенкову, Ж. Лорану, Д. Ерлиху, К. Томасу, которые инициировали исследования природных внехромосомных элементов и оказывали всестороннее содействие при выполнении работы, а также В. В. Лысаку за помощь, оказанную при опубликовании данной монографии. 8
9 I. RCR-ПЛАЗМИДЫ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ Многокопийные плазмиды грамположительных бактерий размером до 10 kb, как правило, реплицируются по механизму "катящегося кольца" (плазмиды RCR-типа). В процессе копирования плазмид RCR-типа образуются промежуточные структуры, напоминающие греческую букву сигма (σ) и выявляются интермедиаты в виде однонитевой ДНК [282]. Кроме того, белки репликации плазмид RCR-типа (Rep-белки) и сайты инициации вегетативной репликации (dso и sso) характеризуются рядом отличительных особенностей [171, 284, 224, 166]. За рубежом опубликовано достаточно большое число обзоров, посвященных плазмидам RCR-типа [142; 149, 120, 150, 73, 85, 151], тогда как в отечественной литературе работы такого плана полностью отсутствуют. Вследствие этого, в настоящей главе будут рассмотрены особенности процесса копирования, присущие этим широко распространенным внехромосомным генетическим элементам грамположительных бактерий Модель репликации RCR-плазмид Отличительной особенностью данного типа репликации является её однонаправленность и асимметричный характер, выражающийся в разобщении синтеза ведущей и запаздывающей нитей плазмидной ДНК по времени. Схематично процесс репликации может быть представлен следующим образом (рис. 1). Инициация осуществляется за счет плазмидного Rep-белка, который производит надрез в родительской [+] нити в области сайта инициации репликации dso (double-strand origin) с образованием свободного 3'-OH конца, который служит затравкой для синтеза ведущей нити ДНК на матрице [-] нити и обеспечивается ДНК полимеразой III. Белок хеликаза, продукт хромосомального pcr-гена, расплетает двунитевую плазмидную ДНК, при этом стабилизация возникающих однонитевых участков молекулы осуществляется за счёт SSB белков. Синтез ведущей нити завершатся в области dso, в результате чего образуется два продукта:1) двунитевая молекула ДНК, состоящая из родительской [-] и вновь синтезированной [+] нити и, 2) однонитевая молекула ДНК, представляющая собой вытесненную [+] родительскую нить. Следует отметить, что именно наличие однонитевых интермедиатов репликации является основным критерием, свидетельствующим в пользу копирования в соответствии с механизмом «катящегося кольца» [282]. 9
10 Рис. 1. Схема репликации плазмид в соответствии с моделью «катящегося кольца». Выделяемые этапы репликации установлены экспериментально и основываются на результатах, полученных при изучении плазмиды рт181 [297, 298, 250, 252, 143]. Модель не является универсальной и репликация некоторых плазмид RCR-типа может осуществляться иным путем, в частности, существуют отличия на стадии синтеза ведущей нити плазмидной ДНК [75, 224, 211]. На рисунке указаны белки, детерминируемые генами плазмид (Rep-белок) и хромосомы Pcr-хеликаза, ДНК полимераза III (Pol III), ДНК полимераза I (Pol I), SSB-белки, ДНК-гираза, а также сайты инициации репликации ведущей (dso) и запаздывающей (sso) нитей плазмидной ДНК. Описание этапов, изображенных на рисунке, приведено в тексте. Рисунок заимствован у [85]. 10
11 Вторая стадия репликации заключается в синтезе двунитевой молекулы ДНК (запаздывающей нити) на матрице вытесненной [+] нити. Синтез запаздывающей нити инициируется в области сайта инициации sso (single strand origin) и осуществляется фрагментами Оказаки с участием РНК полимеразы клетки-хозяина, обеспечивающей формирование РНК-затравок для ДНК полимеразы III. ДНК полимеразы I удаляет РНК-затравки и застраивает бреши, образующиеся между двумя соседними фрагментами Оказаки. Завершающим этапом является соединение фрагментов ДНК-лигазой и суперскручивание молекулы за счёт активности ДНК гиразы Классификация RCR-плазмид Впервые модель «катящегося кольца» была предложена для объяснения процесса репликации геномов бактериофагов E. coli, содержащих однитевую кольцевую ДНК [81, 255, 8, 324, 9, 268]. Плазмиды RCR-типа впервые были обнаружены в клетках грамположительных бактерий Staphylococcus aureus [164, 283]. К настоящему времени описано большое число RCR-плазмид у грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также у Mycoplasma mycoides и Treponema denficola (табл. 1). Следует отметить, что большинство внехромосомных генетических элементов RCR-типа относится к разряду криптических. Наличие фенотипических маркеров присуще плазмидам, обнаруженным в клетках бактерий рода Staphylococcus и Streptococcus, которые, как правило, определяют устойчивость к антибиотикам (тетрациклин, хлорамфеникол, стрептомицин, канамицин). Присутствие генов антибиотикорезистентности в геноме данных внехромосомных элементов в сочетании с небольшими размерами и наличием уникальных сайтов рестрикции обусловили их использование в качестве векторов для молекулярного клонирования [155, 111]. Зависимость репликации определенных плазмид RCR-типа от температурного фактора позволило применять их в качестве векторов для транспозонного мутагенеза [294, 316, 237, 192]. Некоторые внехромосомные элементы RCR-типа (например, pc194, pmv158, pwv01) способны наследоваться в клетках многих бактериальных хозяев, включая E. coli [75, 111, 181], что обеспечивает возможность их использования для генетических манипуляций с бактериями различных таксономических групп. 11
12 На основании различий в организации сайта начала репликации ведущей нити плазмидной ДНК (dso-сайта), белков, инициирующих репликацию (Rep-белков), а также систем, определяющих копийность, все RCR-плазмиды разделены на пять классов и представлены семействами pt181, pc194, pe194/pmv158, psn2 и pjj110/pjvj (табл. 1). Плазмиды, принадлежащие к одной классификационной группе, характеризуются высокой степенью гомологии rep-областей и сходными механизмами наследования в клетке-хозяине. Отличительной особенностью систем репликации плазмид семейства рт181 является их сходство с таковыми фага М13 E. coli [9], а плазмид семейства рс194 с системой репликации фага φх174 [262]. Классификация плазмид RCR-типа Таблица 1 Семейство и Размер, Детерминируемый Источник Исходный хозяин представители kb признак литературы pт181 pт181 4,4 Тс Staphylococcus aureus 154 pс221 4,6 Cm Staphylococcus aureus 245 pс223 4,6 Cm Staphylococcus aureus 245 pcw7 4,2 Cm Staphylococcus aureus 225 phd2 2,1 криптическая Bacillus thuringiensis 200 plug10 3,1 Cd Staphylococcus lugdunensis 51 pog32 2,5 криптическая Leuconostoc oenos 37 ps194 4,4 Sm R Staphylococcus aureus 245 pt127 4,4 Tc Staphylococcus aureus 225 ptz10 (ptz12) 2,5 Cm Corynebacterium xerosis 6 pub112 4,1 Cm Staphylococcus aureus 245 pe194/ pls1 pe194 3,7 Em Staphylococcus aureus 225 pa1 2,8 криптическая Lactobacillus plantarum 296 pc1305 8,7 криптическая Lactococcus lactis 118 pci411 2,9 криптическая Lactococcus lactis 57 pfx2 2,5 криптическая Lactococcus lactis 307 pkmk1 1,9 криптическая Mycoplasma mycoides 157 pls1 (pmv158) 5,5 Tc Streptococcus agalactiae 75 psh71 2,1 криптическая Lactococcus lactis 69 pwv01 3,3 криптическая Lactococcus lactis
13 Продолжение таблицы pc194/ pub 110 pc194 2,9 Cm Staphylococcus aureus 225 pamα1 9,6 Tc Streptococcus faecalis 236 pbc1 1,6 криптическая Bacillus coagulans 68 pbc16 4,6 Tc Bacillus cereus 17 pbp614 5,6 криптическая Bacillus popilliae 187 pc30i1 2,1 криптическая Lactobacillus plantarum 270 PCA2.4 2,4 криптическая Synechocystis sp. 309 pcb101 6,0 криптическая Clostridium butyricum 36 pcb2,4 2,3 криптическая Synechocystis sp. 310 pcc5,2 5,2 криптическая Synechocystis sp. strain PCC pgt5 3,4 криптическая Pyrococcus ahyssi 83 pjdb21 2,5 криптическая Selenomonas ruminantium 320 pkym 2,1 криптическая Shigella sonnei 311 plab1000 3,3 криптическая Lactobacillus hilgardii 145 plo13 3,9 криптическая Leuconostoc oenos 91 plp1 2,1 криптическая Lactobacillus plantarum 26 pox 6 3,2 Cd Staphylococcus aureus 225 prf1 4,2 криптическая Plectonema sp. 235 strain PCC 6402 prbh1 (ptb19) 1,75 Km Bacillus thermofilis 215 psh1415 6,1 Sl Bacillus pumilus 116 ptd1 2,7 криптическая Treponema clenticola 189 ptht15 4,5 Tc Bacillus thermofilis 126 pub110 4,5 Km Staphylococcus aureus 201 puh1 5,7 γ- Glut Bacillus subtilis 114 pva ,2 криптическая Streptococcus ferus 176 pwc1 2,8 криптическая Lactococcus lactis 240 pwgb32 2,4 Sm R Staphylococcus aureus 108 P ,4 криптическая Lactobacillus pentosus 242 pta pta1019, pls15, pls17, pls19, pls24, pls26, puh1- puh8 5,8 криптическая Bacillus subtilis
14 Продолжение таблицы pta pta1023, pbaa1, p1410 pta1060- pta1061, pls11 - pls12, pbs2 6,6 криптическая Bacillus subtilis 8,7 криптическая Bacillus subtilis pta1040, LS13 7,7 криптическая Bacillus subtilis pta1030- pta1031 pta1050, pls , ,2 криптическая Bacillus subtilis 289 8,4 криптическая Bacillus subtilis pftb14 8,2 криптическая Bacillus аmyloliquefaciens psn2 psn2 1,3 криптическая Staphylococcus aureus 153 pbi143 2,7 криптическая Bacteriodes fragilis 271 pe5 2,1 Em Staphylococcus aureus 244 pe12 2,2 Em Staphylococcus aureus 244 pim13 2,1 Em Bacillus subtilis 244 pne131 2,1 Em Staphylococcus epidermidis 244 pt48 2,1 Em Staphylococcus aureus 225 ptcs1 1,3 криптическая Staphylococcus aureus 225 pzmo2 1,9 криптическая Zymomonas mobilis 292 pjj 110/pJVJ pij110 8,6 криптическая Streptomyces phaeochromogenes 148 pbl1 4,5 криптическая Brevibacterium lactofermentum 88 pjv1 10,3 криптическая Streptomyces phaeochromogenes 263 psg5 3,3 криптическая Streptomyces ghanaensis 218 psn22 11,0 криптическая Streptomyces nigrifaciens 147 Другие RCR плазмиды pg12 9,7 криптическая Bacillus thuringiensis
15 Продолжение таблицы pgrb-1 1,7 криптическая Holobacterium sp. 269 phk2 10,5 криптическая Holobacterium sp. 122 phpk255 1,5 криптическая Helicobacter pylori 158 ptx14-1 5,4 криптическая Bacillus thuringiensis 53 ptx14-3 7,6 криптическая Bacillus thuringiensis 5 pvt ,0 криптическая Actinobacillus actinomycetemcomitans 93 Примечание: * - криптические плазмиды, Cm устойчивость к хлорамфениколу, Cd устойчивость к ионам кадмия, Em- устойчивость к эритромицину, Km устойчивость к канамицину, Sm устойчивость к стрептомицину, Sm R множественная лекарственная резистентность, Tc устойчивость к тетрациклину; Sl устойчивость к высоким концентрациям солей; γ-glut синтез γ- глютамилтранспептидазы; систематическое положение плазмид данной группы не установлено. Таблица составлена на основании результатов, представленных в работах [149, 150, 142, 120]. Особого внимания заслуживают плазмиды RCR-типа, обнаруженные в клетках изолированных из природных источников бактерий B. subtilis и близкородственных им в филогенетическом отношении B. аmyloliquefaciens. Анализ большого числа независимо выделенных внехромосомных элементов из клеток этих микроорганизмов [278, 279, 289, 115, 216, 278, 3] позволил отнести их лишь к одной классификационной группе, а именно к семейству рс194. Было установлено, что плазмиды данного семейства характеризуется гетерогенностью (результаты рестрикционного анализа и сиквенса) и могут быть разделены на семь подгрупп [204]. Анализ распространения внехромосомных элементов среди, выделенных на территории Беларуси природных штаммов B. subtilis, идентифицированных на основании чувствительности к специфическим бактериофагам, позволил установить, что клетки 20% изолированных микроорганизмов (проанализировано 55 штаммов) содержат плазмиды различной молекулярной массы, при этом в клетках 6 штаммов выявлено по две плазмиды (штаммы N1, 2, 4, 15, 8, 57), остальные бактерии обладали одиночными плазмидами (табл. 2, рис. 2). Таксономическая принадлежность исследованных плазмидсодержащих штаммов к виду B. subtilis была подтверждена посредством рекомбинационного анализа. С этой целью препаратами 15
16 тотальной ДНК, выделенной из плазмидсодержащих клеток, трансформировали бактерии типового штамма B. subtilis 168 (trp - ) c последующей селекцией трансформантов на среде, не содержащей триптофана. В результате во всех случаях имело место формирование trp + рекомбинантов с частотой 2, ,9 10 6, что свидетельствовало о близком родстве выделенных природных штаммов с бактериями B. subtilis и позволило отнести их к данному виду микроорганизмов (табл. 2). Таблица 2 Характеристика плазмидсодержащих бактерий B. subtilis, выделенных из природных источников на территории Беларуси Штамм Чувствительность к фагам B. subtilis AR1 AR3 AR9 θ105 SP01 Частота образования trp + трансформантов (на 1 мкг ДНК) Размер плазмид, (kb) BS4K BS21Z BS BS8 + +/- +/- +/ BS / BS2 + +/- +/ BS4 +/ / BS15 +/- +/- +/- +/ BSN1 +/- - +/- +/ BS19 +/ BS Примечание: «+» наличие хорошо выраженных зон лизиса; «+/-»неотчетливые зоны лизиса; «-» зоны лизиса отсутствуют. 16
17 Рис. 2. Электрофореграмма плазмидных ДНК природных штаммов B. subtilis: Цифрами обозначаются номера дорожек. 1- штамм BS21Z (изолирован из почвы полевой зоны, Минская обл.); 2- штамм BS4K31 (изолирован из пробы дождевой воды, г. Минск); 3- штамм BS1 (изолирован из почвы прибрежной зоны оз. Святское, Гомельская обл.); 4- штамм BS57 (изолирован из почвы прибрежной зоны р. Бобрик, Брестская обл.); 5- штамм BSN1 (изолирован из почвы прибрежной зоны оз. Нарочь, Минская обл.); 6- штамм BS2 (изолирован из почвы прибрежной зоны оз. Нарочь, Минская обл.); 7- штамм BS4 (изолирован из почвы прибрежной зоны оз. Рисловское, Гомельская обл.); 8- штамм BS8 (изолирован из почвы луговой зоны, Гродненская обл.); 9- штамм BS15 (изолирован из почвы прибрежной зоны оз. Рисловское, Гомельская обл.); 10- штамм BS19 (изолирован из почвы лесной зоны, Гродненская обл.); 11- штамм BS72 (изолирован из почвы зоны декаративных насаждений, г. Минск): а, в плазмидная ДНК; б хромосомальная ДНК. 17
18 Уточнение размеров изолированных плазмид, предварительно установленный на основании их электрофоретической подвижности (рис. 2), проводился посредством суммарного анализа масс фрагментов ДНК, образующихся под действием ферментов рестрикции. Таким путём с использованием рестриктаз EcoRI, PstI, StyI, HindIII были рассчитаны размеры мелких плазмид. (табл. 3). Поскольку все крупные внехромосомные генетические элементы имели одинаковую электрофоретическую подвижность (рис. 2), их размер определялся посредством рестрикции одной из них (pbs19) ферментами EcoRI и ClaI и составил 96,7 kb [1]. Таблица 3 Рестрикционный анализ плазмидных репликонов размером до 10 kb, выделенных из природных штаммов B. subtilis. Плазмиды Размер (kb) Размер фрагментов плазмидной ДНК при использовании рестриктаз (в kb) рbs21z, рbs4к31 рbs2, рbs4 рbs15, рbsn1 рbs1, рbs57, рbs8 HindIII EcoRI StyI PstI 6,3 2,2+1,6+1,4+1,1 4,4 +1,9 3,1+2,3 +0,9 5,1 + 1,2 8 3,0+2,0+1,6+1,4 8,0 3,5+2,1 +1,3+1,1 4,7+2,0 +1,3 8 2,2+2,1+1,6+1,4+0,7 8,0 * 5,0+1,9 +1,1 8 3,8+1,2+1,6+1,4 * * 1,7 +6,3 Примечание: «*» - рестрикты плазмидной ДНК не обнаруживались На основании данных рестрикционного анализа все выявленные плазмиды можно разделить на четыре подгруппы (табл. 3). Первую подгруппу составляют плазмиды размером 6,3 kb (pbs21z, pbs4k31), вторая, третья и четвертая подгруппы представлены плазмидами одинакового размера (8 kb), но различающимися сайтами рестрикции. Например, плазмиды первой подгруппы (рbs21z и рbs4к31) содержат четыре сайта рестрикции для фермента EcoRI, тогда как плазмиды второй (рbs2, рbs4) и третьей (рbs15, рbsn1) подгрупп обладают 18
19 одним сайтом рестрикции, а плазмиды четвертой (рbs1, рbs57, рbs8) подгруппы вообще не чувствительны к указанной рестриктазе. Анализируемые плазмиды также отличаются величиной и количеством фрагментов, образующихся под действием ферментов рестрикции HindIII, StyI и PstI. Вполне закономерно, что плазмиды различного размера обладают разными сайтами рестрикции, однако в данном случае подобная гетерогенность выявлена у внехромосомных элементов, не различающихся электрофоретической подвижностью. Следует отметить, что выявленные плазмиды не соответствуют по величине ранее описанным внехромосомным элементам бактерий B. subtilis (табл. 1), что может свидетельствовать о наличии определенных особенностей в их организации. Проверка плазмидсодержащих штаммов на устойчивость к антибиотикам (Cm, Ap, Tc, Tp, Sm, Km, Rif, Ery в конечной концентрации 5, 10, 20 мкг/мл) позволила установить, что почти все изучавшиеся бактерии чувствительны к использованным препаратам. Исключение составляли штаммы 5, 8, 72, клетки которых росли в присутствии стрептомицина в концентрации 10 мкг/мл. Попытки элиминировать признак устойчивости к данному антибиотику с использованием различных интеркалирующих красителей оказались безрезультатными, что может указывать на хромосомную локализацию детерминанты стрептомицинрезистентности. Таким образом, в результате проведенного анализа были изолированы штаммы B. subtilis, клетки которых содержали мелкие плазмиды (6,3 kb и 8,0 kb) и бактерии этого же вида, наследующие крупные внехромосомные элементы (более 90 kb). Согласно результатам других авторов, для большинства бактерий B. subtilis, выделенных из природных источников, характерно наличие мелких криптических плазмид [278, 289], размер которых, как правило, коррелирует с определенным типом репликации. Так, например, плазмиды до 10 kb в основном копируются в соответствии с механизмом «катящегося кольца», тогда как репликация плазмид большего размера осуществляется через тета-структуру [111, 225, 75, 142, 150, 73, 151]. Для внехромосомных элементов грамположительных бактерий довольно распространенной особенностью является наличие нескольких репликонов в составе одного плазмидного генома, однако второй репликон, как правило, является функционально неактивным [106, 14, 228, 246, 236, 129]. Поскольку подобная ситуация создает определенные сложности при характеристике репликативного аппарата, было предпринято клонирование rep-областей некоторых выделенных 19
20 плазмид. Для этих целей использовался вектор pmtl21c, содержащий ColE репликон, обеспечивающий его наследование только в бактериях E. coli. Кроме того, в данном векторе находятся два маркера антибиотикорезистентности, один их которых (Ap R ) экспрессируется в клетках E. coli, а второй (Cm R ) в бактериях B. subtilis. Также имеется полилинкер, содержащий 21 уникальный сайт рестрикции (в частности, KpnI, SmaI, Bam HI, SalI, HindIII, BglII, XhoI, EcoRI, PstI, SacI, StyI), по которым можно осуществлять клонирование чужеродных молекул ДНК [50]. При клонировании rep-областей ДНК выделенных природных плазмиди и вектор pmtl21c обрабатывали одной из вышеперечисленных рестриктаз, смешивали и после лигирования полученной смесью трансформировали клетки B. subtilis с последующим отбором трансформированных бактерий на среде с соответствующим антибиотиком (Cm). Из клеток полученных трансформантов выделялась ДНК гибридных плазмид, используемая в свою очередь для трансформации бактерий E. coli JM105, из которых на завершающем этапе выделялась плазмидная ДНК для дальнейшего анализа. Как видно из таблицы 4, размер репликонов девяти мелких плазмид варьировал от менее 1kb до 6,3 kb. При этом величина клонированных rep-областей плазмид из клеток штаммов BS8 и BS57 был практически одинаков, что лишний раз подтверждает высказанное ранее предположение о сходстве указанных внехромосомных элементов (табл. 3). Результаты дальнейшего анализа клонированных последовательностей позволяют утверждать, что они содержат детерминанты, обеспечивающие репликацию плазмид и их поддержание в клетках бактерий B. subtilis. В пользу этого свидетельствуют следующие данные. Во-первых, ДНК гибридных плазмид, выделенная из клеток E. coli, способна эффективно трансформировать клетки B. subtilis. Во-вторых, 9 из 11 конструкций характеризуются практически абсолютной стабильностью наследования в клетках B. subtilis в течение 20 генераций, утрачиваясь с частотой не превышающей 10 %. Только две гибридные плазмиды (pmtl8, pmtl57) утрачивались клетками в 28% и 18% случаев, соответственно (табл. 4). В-третьих, копийность гибридных плазмид, определяемая на основании результатов элетрофоретического анализа фрагментов рестрикции тотальной ДНК исходных плазмидсодержащих штаммов и бактерий B. subtilis 168, несущих клонированные репликоны, была одинакова. 20
21 21 Зависимость наследования клонированных репликонов от функции ДНКполимеразы I Стабильность наследования клонированных репликонов (%) Наличие ssднк Обозначение клонированного репликона pmtl4k31 pmtl 21Z pmtl1 pmtl8 pmtl57 pmtl2 pmtl4 pmtl15 pmtln1 pmtl19 pmtlbs72 Размер клонированного репликона (kb) Рестриктазы, использованные для клонирования HindIII HindIII-EcoRI HindIII EcoRI EcoRI HindIII PstI EcoRI EcoRI EcoRI BglII Размер выделенных плазмид (kb) >90.0 >90.0 Таблица 4 Характеристика клонированных rep-областей плазмид B. subtilis Штамм BS4K31 BS21Z BS1 BS8 BS57 BS2 BS4 BS15 BSN1 BS19 BS72
22 Рис. 3. Результаты гибридизации ДНК типовых и природных плазмид с минирепликоном pmtln1, меченным [α- 32 P]dCTP. Мини-репликон получен путём клонирования rep-области природной плазмиды pbsn1 в составе вектора pmtlc21. Цифрами обозначены номера дорожек. 1: реперная ДНК; 2-8: типовые плазмиды грамположительных бактерий(2- pamβ1 репликон; 3- ptb19 репликон; 4- pt181; 5- pc194; 6- pe194; 7- pls20; 8- p1414); 9-15: плазмиды, выделенные из природных штаммов(9- из штамма BS15; 10- из штамма BS4; 11: штамм BS2; 12: штамм BS21Z; 13: штамм BS1; 14: штамм BS57; 15: штамм BS4K31). Числа слева указывают размер фрагментов, образующихся в результате электрофоретического фракционирования молекулы реперной ДНК (в п.н.). В результате гибридизационного анализа с использованием в качестве зонда клонированного репликона pmtln1 было установлено, 22
23 что он характеризуется выраженной гомологией с участками исходных мелких плазмид (размером от 6,3 kb до 8,0 kb), изолированных из природных штаммов (BS15, BS4, BS2, BS21Z, BS1, BS57, BS4K31), а также с областью плазмид pc194 и p1414 (типичные представители семейства рс194), но не обнаруживает гомологии с типовыми плазмидами грамположительных бактерий RCR-типа (pt181 и pe194) и плазмидами тета-типа (pamβ1, ртв19, pls20). Полученные данные свидетельствуют об определенном сходстве систем репликации внехромосомных элементов (размером до 10 kb) природных штаммов с rep-областями типичных плазмид семейства pc194 (рис. 3). Следовательно, их можно отнести к плазмидам RCR-типа семейства pc194. Дополнительным доказательством принадлежности изученных плазмид к RCR-типу могут служить результаты анализа промежуточных продуктов, образующихся при репликации гибридных плазмид. Так в шести случаях из девяти проанализированных репликонов было отмечено появление фракции однонитевой ДНК (рис. 4), которая не обнаруживалась при репликации плазмид pmtl21z, pmtl8 и pmtl57, что может быть следствием отсутствия в составе клонированных rep-областей sso сайта инициации запаздывающей цепи, либо снижением его активности в клетках нового хозяина, бактериях B. subtilis 168. Рис. 4: Результаты гибридизации ДНК клонированных rep-областей природных плазмид с вектором pmtl21c, меченным [α- 32 P]dCTP. Цифрами обозначены номера дорожек. 1 - pmtl2; 2 - pmtl15; 3 - pmtl4; 4 - pmtln1; 5 - pmtl1; 6 - pmtl4k31. Стрелками ( ) указаны полосы, соответствующие однонитевым интермедиатам (ssднк), образующимся в результате репликации плазмид. Отличительной особенностью плазмид семейства рс194 является наличие в их составе mob/pre локусов [111, 204, 286], обусловливающих их конъюгативную передачу [228], а так же генов клеточного метаболизма, в частности, определяющих процесс секреции белков (sip), участвующих в регуляции процесса споруляции (rap), а также 23
24 обеспечивающих синтез белков теплового шока (hsp) [204, 286]. Повидимому, наличие указанных генетических детерминант обусловливает их широкое распространение среди природных штаммов микроорганизмов. Однако до сих пор непонятно, почему среди циркулирующих в природе бактерий B. subtilis не обнаруживаются плазмиды RCR-типа, принадлежащие к другим семействам. В настоящее время известно, по крайней мере, 4 семейства RCR-плазмид, многие из которых являются плазмидами широкого круга хозяев и способны стабильно наследоваться в коллекционных штаммах B. subtilis [111, 142, 150]. В тоже время репликативный аппарат B. subtilis сходен с таковым других грамположительных бактерий [183], что дополнительно свидетельствует об отсутствии в клетках этих микроорганизмов препятствий, не позволяющих копироваться RCR-плазмидам других таксономических групп. Тем не менее, ещё раз подтвержденный нашими исследованиями факт распространения среди природных штаммов B. subtilis RCR-плазмид, относящихся лишь к одной таксономической группе, имеет место и требует своего объяснения Функциональная организация плазмид RCR-типа Большинство плазмид RCR-типа характеризуются небольшими размерами (от 1,3 до 10 kb) и представляют собой молекулы ДНК, для репликации которых необходимо присутствие функциональных единиц, обеспечивающих инициацию синтеза ведущей цепи (dso-сайт и rep-ген), а также локусов, регулирующих число копий плазмид. В состав RCRплазмид входят также сайт (либо сайты) инициации синтеза запаздывающей цепи (sso-сайт), который у ряда плазмид представлен несколькими последовательностями. Кроме того, имеются гены, ответственные за мобилизационный либо за конъюгативный переносы (mob/tra), а также детерминанты антибиотикорезистентности (рис. 5). Проведенный функциональный анализ плазмид RCR-типа выявил ряд особенностей. В частности, было установлено, что в ряде случаев, генетические детерминанты, входящие в состав плазмидного репликона, транскрибируются в одном направлении, причем направление транскрипции rep-гена, обычно, совпадает с направлением процесса репликации (исключением является плазмида psn2). Кроме того, к интересной особенности отдельных плазмид RCR-типа можно отнести локализацию сайта начала репликации ведущей цепи (dso-сайта) внутри rep-гена [163, 285]. Отмеченные особенности, по-видимому, зависят от 24
25 регуляции процесса репликации, которая обеспечивает поддержание в клетке определенного числа плазмидных копий. Рис. 5. Функциональная организация типичных представителей пяти семейств плазмид RCR-типа. Стрелками указано направление транскрипции (сплошные стрелки), а также направление репликации (пунктирные стрелки). Обозначения: ori - сайт инициации репликации ведущей нити (dso-сайт), rep - ген, детерминирующий синтез белка инициации репликации, sso- сайт инициации репликации запаздывающей нити, cop - ген, детерминирующий синтез белка репрессора, регулирующего копийность плазмид, pre - ген, детерминирующий синтез рекомбиназы, mob - детерминанта мобилизационного переноса, tra - детерминанты конъюгационного переноса, tet - ген устойчивости к тетрациклину, cat ген устойчивости к хлорамфениколу. Рисунок составлен на основании данных, приведенных в работах [149, 150]. Следует отметить, что в настоящее время наиболее полно изученным является механизм репликации плазмид RCR-типа, принадлежащих к семействам pt181, pc194 и pmv158. Исследование функциональной организации генетических детерминант, ответственных за процессы копирования и регуляции репликации этих плазмид, позволило выяснить особенности передачи наследственной информации этих внехромосомных элементов в ряду поколений (табл. 5). 25
26 Функциональная организация систем репликации плазмид RCR-типа Таблица 5 Семейство pt181 Семейство pc194 Семейство pmv158 Бактерии-хозяева Организация dsoсайта Размер Rep-белка Регуляция репликации Бактерии хозяева Организация dsoсайта Размер Rep-белка Регуляция репликации Бактерии-хозяева Организация dsoсайта Размер Rep-белка Регуляция репликации Staphylococcus aureus Область dso-сайта находится в пределах rep-гена nick-сайт аналогичен таковому бактериофагу М13 Содержит более 300 аминокислотных остатков Обеспечивается антисмысловой РНК Staphyloccocus aureus, Shigella sonnei, Clostridium butyricum, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Plectonema Входит в состав лидерной последовательности rep-гена nick-сайт аналогичен таковому бактериофага ϕх174 Содержит около 300 аминокислотных остатков Обеспечивается антисмысловой РНК Staphyloccocus aureus, Streptococcus agalactiae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus, Lactococcus lactis, Mycoplasma mycoides, Helicobacter pyroli Локализуется перед промотором rep-гена nick-сайт обособлен от сайта связывания Reр-белка Содержит около 200 аминокислотных остатков Обеспечивается антисмысловой РНК и белком репрессором (Сор-белком) Примечание: таблица составлена на основании данных, приведенных в работе [85] Особенности организации dso-сайтов инициации репликации ведущей нити ДНК Репликация ведущей нити ДНК происходит однонаправленно, начинаясь в сайте инициации dso, протяженность которого, как правило, не превышает 100 п.н. У некоторых внехромосомных элементов указанная последовательность перекрывается с последовательностью rep-гена, кодирующей белок инициации, у других она расположена перед данным геном [152, 248, 21, 100, 109, 66, 24, 318]. В случае плазмид 26
27 pt181, pls1, pkym нуклеотидная последовательность dso-сайта обеспечивает формирование структуры в виде петли [161, 229]. После присоединения белка инициации к области dso-сайта образуется частично открытый комплекс, имеющий форму креста, обеспечивающий связывание одного из активных центров Rep-белка с однонитевым участком dso-последовательности [161, 222], что приводит к разрыву фосфодиэфирной связи в ДНК плазмиды и облегчает последующий процесс присоединения набора репликативных белков, инициирующих репликацию. В пределах dso-области локализовано два сайта, один из которых представляет высокоспецифическую последовательность (bind-сайт), с которой нековалентно связывается Rep-белок, а во втором (nick-сайт) происходит надрез нити плазмидной ДНК (рис. 6). Плазмиды, принадлежащие различным семействам могут отличаться расположением указанных сайтов. Например, у плазмид семейств pt181 и pc194 они локализованы рядом, тогда как у плазмид семейства pmv158 они пространственно разделяются последовательностями, протяженностью в нуклеотидов [164, 163, 284, 298, 312, 210, 214, 285]. Область nick сайта, в отличие от bind-сайта, содержит консервативные последовательности, практически одинаковые у плазмид одного семейства [111, 225, 75, 142, 262, 84, 149]. Последовательности nick-сайтов некоторых плазмид гомологичны функционально идентичным последовательностям определенных бактериофагов E. coli; в частности nick-сайт плазмид семейства pt181 гомологичен таковому фага М13 [73], а плазмид семейства pc194 фага ϕx174 [111], в тоже время у плазмид семейства pmv158 подобной гомологии не обнаружено [166]. Для dso-последовательностей характерно присутствие прямых и инвертированных повторов. Так, например, в пределах bind сайта плазмиды pt181 расположено два инвертированных повтора, примыкающие к nick сайту, а в пределах аналогичной последовательности плазмиды pmv158 обнаруживаются три прямых повтора, располагающихся на некотором удалении от него [298, 73, 85] (рис. 6). Последовательность nick-сайта, как правило, фланкирована инвертированными повторами, формирующими вторичную структуру в виде «шпильки» [164, 162, 248, 23, 109, 273, 210] (рис. 6). Имеются экспериментальные доказательства, что для инициации репликации RCR-плазмид необходимо наличие двух функциональных единиц, представленных сайтами bind и nick [109, 134, 100, 217, 313], тогда как 27
28 для терминации репликации достаточно лишь небольшой последовательности нуклеотидов, локализованной в пределах nick-сайта [134, 99, 313, 322]. Рис. 6. Организация dso сайтов инициации репликации плазмид pmv158 (а) и pt181 (б). На рисунке указаны bind и nick сайты, с которыми взаимодействует белок инициации репликации, а также участки, богатые А/Т и G/C парами. Гены, детерминирующие синтез белков инициации плазмиды pmv158 и рт181 (repb и repc), транскрибируются с промоторов P cr и P rep, соответственно. В нижней части рисунка изображены "шпилечные структуры", образованные инвертированными повторами, и указана локализация nick сайтов, в которых осуществляется надрез нитей плазмидной ДНК. Рисунок заимствован у [73]. В частности, у плазмид pc194 и pt181 выявлена последовательность размером 18 п.н., входящей в состав nick-сайта, наличие которой вполне достаточно для терминации процесса репликации [109, 322]. Терминирующая последовательность может распознаваться rep-белками, детерминируемыми плазмидами одной классификационной группы. Например, терминация репликации плазмиды рс221 может осуществляться rep-белком близкородственной плазмиды рт181 [133]. Способность Rep-белков обеспечивать терминацию репликации ДНК близкородственных плазмид свидетельствует о выраженной консервативности последовательностей ДНК, необходимых для завершения процесса копирования. 28
29 Для некоторых плазмид, в частности рт181, достаточно подробно изучен процесс инициации и терминации синтеза ведущей нити ДНК и выявлена неодинаковая функциональная активность участков nick-сайта, образующих шпилечную структуру ограниченную инвертированными нуклеотидными повторами (IRII) (рис. 6). Продемонстрировано, что в разрезании молекулы плазмидной ДНК ключевую роль играет правый повтор IRII и последовательность шпильки [323], в то время как в процессе терминации репликации обязательным является наличие левого повтора IRII [321]. Таким образом, dso-область представляет собой нуклеотидную последовательность, в которой происходит связывание Rep-белка (в области bind-сайта), разрезание плазмидной молекулы (в области nickсайта) с образованием свободного 3'-ОН конца, необходимого для начала процесса репликации и, наконец, разрезание вновь синтезированной последовательности с восстановлением кольцевой структуры (в области nick-сайта). При этом в результате процесса терминации происходит присоединение небольшого фрагмента ДНК nick-сайта размером 10 п.н. к тирозиновому остатку Rep-белка, что приводит к его инактивации и неспособности участвовать в следующем раунде репликации Характеристика Rep-белков Белки инициации репликации плазмид RCR-типа принадлежат к классу ферментов, осуществляющих локальное расплетение и разрыв фосфодиэфирных связей в молекуле плазмидной ДНК в области dsoсайта. Разрыв осуществляется посредством нуклеофильной атаки фосфата в молекуле ДНК гидроксильной группой аминокислоты (чаще всего тирозина) либо воды. В зависимости от типа гидроксильного донора выделяют два механизма, посредством которых может происходить разрыв в цепи ДНК с последующим восстановлением её кольцевой структуры. Первый механизм характерен для ферментов класса топоизомераз I типа [188], сайт-специфических рекомбиназ [232, 86] и белков инициации репликации некоторых бактериофагов [257, 291, 113]. Разрыв фосфодиэфирных связей указанными белками осуществляется за счет присутствия в их составе аминокислотных остатков тирозина, содержащих реакционно-активную гидроксильную группу, способную вступать в реакцию трансэтерификации, в результате которой на первом этапе возникают ковалентные связи между молекулой ДНК и 29
30 аминокислотой (тирозил-фосфодиэфирные связи), а на втором этапе вследствие обратной реакции, происходит восстановление кольцевой структуры ДНК и отделение молекулы белка, как правило, содержащей модифицированный тирозиновый остаток. Второй механизм, приводящий к разрыву нити ДНК, является следствием реакции гидролиза и связан с нуклеофильными свойствами молекулы воды. Этот тип реакции присущ ряду экзо- и эндонуклеаз и протекает с участием эффективных катализаторов, в качестве которых выступают белки, содержащие аминокислотные остатки, обладающие γ- карбоксильными группами (глютамин и аспарагин), либо ионы металлов [90, 12]. Суть данной реакции сводится к замещению протонов водорода в гидроксильной группе молекулы воды, благодаря чему она переходит в активную форму и обеспечивает гидролиз фосфодиэфирной связи в молекуле ДНК [219]. Основная функция Rep-белков плазмид RCR-типа состоит в осуществлении разрыва фосфодиэфирной связи в молекуле плазмидной ДНК в nick-сайте с образованием свободного 3'-OH конца, который служит затравкой для синтеза ведущей нити. Однако роль данного белка не ограничивается стадией инициации, а также необходима для терминации репликации ведущей нити, когда осуществляется её разрыв c последующим восстановлением кольцевой структуры. В молекулах Repбелков выявляется несколько консервативных аминокислотных последовательностей, обнаруживающих явную гомологию с последовательностями, имеющимися в Tra/Mob белках (детерминируют функцию конъюгации и мобилизации), а также белках инициации репликации бактериофагов E. coli, содержащих однонитевую ДНК [231, 127, 166, 300]. В белках инициации репликации плазмид RCR-типа существует два каталитических центра, в составе одного из которых имеются консервативные последовательности, представленные остатками тирозина [284, 224], а второй содержит так называемый «HUH мотиф», обеспечивающий металлсвязывающую активность [166]. Именно благодаря наличию указанных последовательностей данные белки способны обеспечивать инициацию и терминацию синтеза ведущей нити молекулы плазмидной ДНК. Причём процесс инициации всегда осуществляется посредством реакции трансэтерификации, тогда как терминация репликации может происходить как за счёт трансэтерификации, так и вследствие прямого гидролиза молекулы ДНК [224]. Функциональный анализ белков инициации репликации позволил установить, что они не имеют последовательностей, свойственных ДНК 30
31 связывающим полипептидам, в частности не обнаружено НТН мотифов [75]. Отсутствуют также последовательности, обеспечивающие димеризацию белковых молекул, а именно LZ мотифы, исключение составляет белок инициации репликации плазмиды pmv158, содержащий данный домен [75]. Изучение аминокислотного состава активных центров Rep-белков позволил установить обязательное присутствие остатков тирозина, с функциональной группой которого ассоциируется их ферментативная активность. Некоторые плазмиды RCR-типа содержат консервативные нуклеотидные последовательности, выступающие в роли энхансеров репликативного процесса. В этом отношении наиболее хорошо изучен, так называемый, cmp-элемент плазмиды рт181 [59, 99, 101]. Данная последовательность размером 100 п.н., локализованная на расстоянии 1 kb от dso-сайта [101], усиливает взаимодействие Rep-белка с сайтом инициации репликации ведущей нити [99] Rep-белки семейства pt181 Из Rep-белков плазмид семейства pt181, наиболее изученными являются белки RepC плазмиды pt181, RepD плазмиды pc221 и RepE белок плазмиды ps194, функциональная активность которых свойственна их димерным формам, причем димеризация может осуществляться как до, так и после связывания с молекулами ДНК [323]. Взаимодействие данных белков с сайтами связывания (bind-сайты) в dsoобласти осуществляется за счет С-терминального домена, представленного 6 аминокислотными остатками [76, 297]. На некотором расстоянии от С-терминального локуса располагаются тирозиновые остатки (Tyr191 в случае RepC-белка плазмиды рт181 и Tyr188 для молекулы RepD-белка плазмиды рс221), играющие ключевую роль в определении ферментативной активности указанных белков [285]. После связывания белка инициации с bind-сайтом в dso-области в nick-сайте происходит разрезания молекулы ДНК c образованием фосфодиэфирной связи между 5'-ApT-3' концом молекулы ДНК и остатком тирозина одной из молекул димера. Свободный остаток тирозина второй молекулы димера участвует в процессе терминации. При этом в процессе терминации репликации ведущей цепи происходит модификация тирозина одной из субъединиц димера, приводящая к образованию гетеродимерного белка RepC/C, неспособного участвовать в следующем раунде репликации [143]. 31