Продукты водорослевого происхождения в лечебной практике. Пищевая лечебно-профилактическая добавка «Медные производные хлорофилла» (часть 2)
В последние годы одной из перспективных биологически-активных пищевых добавок является БАД «МЕДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ХЛОРОФИЛЛА» (МПХ). Она является продуктом переработки морской капусты с максимальным сохранением всех ее ценных качеств. Основной технологический процесс: экстрагирование сырья при температуре 50-60° в течение часа. В результате получается липидный комплекс (смола), который содержит хлорофилл и его производные, каротиноиды, жиры и полиненасыщенные жирные кислоты с уникальными свойствами (например, арахиденовая кислота обладает онкопротективными свойствами), растительные стерины, микроэлементы, водорастворимые витамины (26). Этот комплекс, в свою очередь, обрабатывается раствором хлорной меди при температуре 60-70° - получается МПХ-паста, из которой в свою очередь готовятся различные формы МПХ – водная, масляная, спиртовая. Для производства МПХ также может использоваться такой вид сырья, как зелень хвойных пород деревьев (3).
В России для данной БАД используется название «Медные производные хлорофилла». В списке пищевых добавок, разрешенных к применению при производстве пищевых продуктов реестра СанПиН 2.3.2.560-96 (Москва –1997) зарегистрирована под названием «Медные комплексы хлорофиллов» COPPER CHLOROPHYLLS. Код Е 141. В англоязычных источни-ках встречается под названиями: Chlorophyllin, Sodium and copper salt of chlorophyll, Cuprofilin.
МПХ может быть представлена в виде трех форм:
- Водорастворимая - натрий-медь-хлорофиллин
- Спирторастворимая - медь-феофорбид
- Жирорастворимая - медь-феофорбид
Водный раствор (натрий-медь-хлорофиллин) готовится на основе медь-феофорбида. Поскольку спирто- и жирорастворимые формы представлены именно медь-феофорбидом и получили более высокую оценку в связи с более высокой биологической активностью, мы приводим анализ химической структуры Медь-феофорбида.
Химическим предшественником всех природных порфиринов (хлорофилла, гема, цитохромов и др.) является протопорфирин-9. Хлорофилл и его производные - пигменты являются порфиринами с двумя карбоксильными заместителями. Гидролиз фитоловой эфирной связи хлорофилла приводит к образованию хлорофиллида (хлорофиллид, лишенный атома металла, известен как феофорбид)(17). Феофорбид, обработанный уксуснокислой солью меди, либо хлоридом меди дает медный аналог хлорофилла (9) – медные производные хлорофилла (МПХ). Медь-феофорбид обладает высокой устойчивостью: ионы меди не удаляются из порфириновых комплексов даже при действии концентрированной соляной кислоты. Двухвалентные ионы меди, включенные в порфириновый цикл имеют ко-ординационное число – 4. Эти координационные возможности заняты связями с атомами азота порфиринового кольца, в силу этого комплексы порфиринов с этими металлами не могут присоединять экстралиганды, независимо от структуры входящего в комплекс порфирина. Биологически активные металлопорфирины (в т.ч. хлорофилл) выполняют свои функции только при ассоциации с белковыми и липидными молекулами. Поэтому их способность образовывать экстракомплексы является одной из основных и определяется количеством и свойствами свободных координационных связей центрального атома металла, не занятых связью с атомами азота порфиринового цикла (9) . Хлорофиллы образуют комплексы с белками in vivo и могут быть выделены в таком виде (17).Молекула гемо-глобина имеет сходное строение. Параллельно изучая химическое строение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) - основного фермента в цикле тканевого дыхания у человека, можно отметить чрезвычайно близкое их родство. Все они принадлежат к группе хромопротеидов (класс сложных белков).
Медь-феофорбид в своей основе имеет порфириновое кольцо с атомом металла в центре, в данном случае атомом меди, который координационно связан с атомами азота. Атомы металла, включенные в форбинное кольцо металлопорфирина, придают молекуле разные свойства, в том числе разную способность к образованию смешанных комплексных соединений, экстралигандов (9). Введение в молекулу производного хлорофилла атома металла ведет к повышению его биологической активности.
Выбор атома меди обусловлен высокой биологической активностью данного металла, в том числе противовоспалительной (2). Химическое родство хлорофилла, гемоглобина и СДГ открывает широкие возможности использования препаратов хлорофилла в медицине.
В продукте – МПХ-пасте содержится до 25% в пересчете на сухое вещество безфитольных производных хлорофилла (феофорбиды «а» и «в», хлорин, родин), медь-феофитин, а также медные соли смоляных (абиетиновая, дегидроабиетиновая, изопимаровая и др.) и жирных (олеиновая, линолевая, лигноцериновая, пальмитиновая и др.) кислот (3).
Хлорофиллин образует комплексные соединения с белками и продуктами их распада в кишечнике (6). Вероятно, биологический эффект имеют именно эти комплексы при всасывании в кровоток. Все хлорофиллпротеиды, включая МПХ, при поступлении в организм человека при прохождении по желудочно-кишечному тракту большей частью не распадаются, в кишечнике не всасываются. Большая часть выделяется в неизмененном виде с калом или в виде продуктов распада под действием кишечных бактерий, меньшая часть выводится с мочой в виде продуктов распада порфиринов (5).
Согласно заключению НИИ Питания РАМН, суточное поступление Медных производных хлорофилла в организм человека не должно превышать 15 мг/кг массы тела. Реальное поступление МПХ при обычной дозировке на два порядка меньше установленного количества.
За время применения в клинической и лабораторной практике данных о побочных токсических реакциях на МПХ не было выявлено.
РОЛЬ И МЕСТО МЕДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА СРЕДИ ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (СУБСТРАТОВ) В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА
Медные производные хлорофилла по химическому строению являются металлопорфиринами, которые, как и железопорфирины (например, гем) входят в группу гемопротеидов. К группе гемопротеидов относятся гемоглобин и его производные, миоглобин, хлорофиллсодержащие белки и ферменты (вся цитохромная система, каталаза и пероксидаза). Все они содержат в качестве небелкового компонента структурно-сходные железо- (или магний-, или медь-порфирины), но различные по структуре и составу белки, обеспечивая тем самым разнообразие их биологических функций (5). Гемопротеиды наряду с флавопротеидами входят в подкласс хромопротеидов из класса сложных белков. Хромопротеиды наделены рядом уникальных биологических функций, они участвуют в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как фотосинтез, дыхание клеток и целостного организма, транспорт кислорода и углекислоты, окислительно-восстановительные реакции и т.д. (5).
В процессах клеточного дыхания, т.е. биологического окисления принимают участие такие представители класса хромопротеидов как цитохромы, убихинон, гем, сукцинатдегидрогеназа. Как было показано выше МПХ очень близок по химическому строению к перечисленным участникам тканевого дыхания, и мы с достаточными основаниями можем предполагать такую же близость их биологических функций, то есть участие МПХ в процессах клеточного дыхания.
Определение места МПХ в системе биоорганических соединений очень важно, так отнесение МПХ к классу хромопротеидов дает нам право воспользоваться положением из Международной программы по химической безопасности (МПХБ) совместной с объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам, которое гласит: «любая пищевая добавка, распадающаяся полностью в продукте или пищеварительном тракте на вещества, которые являются пищевыми или входят в состав организма, могут быть оценены удовлетворительно… на основании только биохимических и метаболических исследований…» (30).
Представители химического класса порфиринов и производные порфиринов широко используются и изучаются в прикладной химии и физике. Изучение этих химических соединений является новым перспективным направлением на данном этапе развития науки.
Начавшееся широкое применение порфиринов, в том числе и природных, в химии, пищевой промышленности и медицине поставило вопрос о разработке новых эффективных методов их получения, поскольку существующие основываются главным образом на извлечении этих соединений из сырья растительного или животного (мышцы, кровь, моча) происхождения. Известно, что порфирины широко распространены в природе среди микроорганизмов, где они выполняют различные биохимические функции, участвуя в процессах фотосинтеза, дыхания, сульфат-редукции, метаногенеза и некоторых других (8).
Введение экзогенных биологически активных порфиринов в культивируемые клетки вызывало большее по сравнению с действием радиации торможение митотической активности в 2-4 раза и увеличение цикла первого клеточного деления в 1,5-3 раза. Задержка пролиферации обеспечивала, по-видимому, больше времени на репарацию повреждений, что реализовывалось в снижении уровня хромосомных аберраций, формировании морфологически полноценных колоний и повышении общего уровня выживаемости. В целом установлено, что отдельные соединения из класса порфиринов эффективно стимулируют пострадиационное восстановление поврежденных клеток и тканей, в том числе при пролонгированном облучении (38).
Исследование природных порфиринов в экспериментальной медицине Изучались возможности применения солей хлорофилла в фармакологии, при патологии ЦНС, туморогенезе, атеросклерозе, кожных болезнях, патологии легких.
Cannon-GB показал перспективность и важность использования порфиринов. Разработки данного направления медицины активизировались в последнем десятилетии. Наибольший интерес применения порфиринов в клинике вызывают три области медицины - фотодинамическая терапия рака, гематологические болезни (в том числе порфирия) и лечение различных форм желтух. Эффективность применения порфиринов в клинико-фармакологическом аспекте сравнивается с использованием липосом. Имеются в виду пути доставки лекарственного вещества и утилизации его в организме. В настоящее время идет речь о создании новых “порфириновых” лекарственных форм. Сейчас изучаются биораспределение, устойчивость, связывание и токсикология порфиринов(46).
Marks-GS показал что металлопорфирины, в частности цинк- и кобальт- порфирины участвуют в метаболических процессах при посредстве гема-оксигеназы и участвуют в формировании нейрофизиологического феномена длительного возбуждения в гипоталамусе (42).
В последние годы для фотохимической терапии опухолей широко используется введение в организм порфиринов. Ввиду невысокой избирательности порфиринов, они накапливаются в различных клетках, в том числе и в лимфоцитах, которые в свою очередь, в значительных количествах локализуются в облучаемых пораженных участках (37).
Park-KK et all продемонстрировали химиопревентивную активность хлорофиллина, натриевых и медных солей хлорофилла в эксперименте против туморогенеза, вызванного бензпиреном и его производными у мышей. Хлорофиллин назначался в дозе 15 мг/кг массы тела через зонд за 30 минут до местного нанесения канцерогена на кожу. Хлорофиллин быстро распределялся в коже и других тканях организма и в результате давал снижение частоты и встречаемости рака кожи у мышей. На основании этого автор делает заключение о том, что хлорофиллин - это потенциальный химиопревентивный агент (39). Хлорофилл и хлорофиллин - водорастворимые соли хлорофилла обладают антимутагенной активностью против канцерогенеза, вызванного гетероциклическими аминами и афлатоксинами. Эксперимент проводился на самках крыс, которым хлорофиллин добавлялся в пищу в количестве 1% от от массы суточного рациона в течение 54 недель, вместе с этим крысы получали канцероген внутрь, контрольная группа животных хлорофиллин не получала Результаты показали значительное снижение частоты встречаемости опухолей молочной железы и толстого кишечника у животных , которые получали хлорофиллин (43).
Vlad-M et all в 1995 году в США продемонстрировали эффективность купрофиллина у крыс при экспериментальном атеросклерозе. У крыс, получавших пищу, богатую липидами было зафиксировано статистически достоверное повышение холестерола, липидов и триглицеридов. Одна группа животных в качестве лечения экспериментального атеросклероза получала 90 гр купрофиллина. У этих животных было отмечено статистически достоверное снижение показателей липидного спектра крови, а также понижение концентрации меди в крови, по сравнению с группой нелеченных животных. Более того, автор отмечает, что у животных леченных купрофиллином была отмечена минимальная жировая инфильтрация аорты, по сравнению с группой контроля (40).
При изучении эффектов МПХ на примере модели фиброзирующего альвеолита в НИИ пульмонологии МЗ РФ у животных (на примере крыс), получавших в качестве лечебного средства МПХ выявлены следующие достоверно значимые отличия от контрольных (нелеченных) животных: гистологически не выявлено образование соединительной ткани в легких; сохранялись нормальные значения легочного и сердечного весовых индексов, увеличение массы тела соответствовало возрастным нормам; значительно менее выражена гипертрофия правого желудочка сердца и надпочечников; увеличена функциональная активность альвеолярных макрофагов. Возможными механизмами реализации терапевтического эффекта МПХ и торможения фиброзирующего процесса в легких исследователи считают стимуляцию пролиферации бронхоальвеолярного эпителия, снижение повреждающего действия активных метаболитов кислорода, инициированных блеомицетином, на легочную паренхиму в результате проявления антиоксидантных свойств МПХ (12).
В литературе описаны выраженный бактериостатический, вирусоцидный (25), бактерицидный (15), противогрибковый (15) эффекты МПХ. Среди чуствительных микроорганизмов присутствуют грампо-ложительная и грамотрицательная флора, аэробы и анаэробы, дрожжеподобные и нитчатые грибы (15). Как следствие этого, имеется выраженный противовоспалительное действие МПХ (15,26).
Механизм антимикробного действия МПХ обеспечивается за счет мощной стимуляции фагоцитоза в 3-5 раз и активных катионов меди, усиленный влиянием спирта - при спиртовой форме субстанции (15). Этот механизм может иметь место только in vivо.
Детально описаны микробиологические исследования МПХ – водных, жирорастворимых и спиртовых растворов (33). Жирорастворимые МПХ оказывали антимикробное действие в концентрациях 1-4 мг/мл и были особенно активны в отношении грамположительных бактерий (стафилококки, микрококки, бациллы, сарцины). Водорастворимые МПХ проявляли антимикробную активность в более высоких концентрациях, как в отношении грамотрицательной микрофлоры (16 мг/мл) так и в отношении грамположительной (2-8 мг/мл). В целом, грамотрицательные микроорганизмы (кишечные палочки, сальмонеллы и псевдомонады), оказались более устойчивы к действию МПХ, при этом их рост тормозился лишь при концентрациях 4-16 мг/мл. Что касается антимикробной активности 96% спиртового раствора с МПХ, то за счет спирта обеспечивается полная холодная стерилизация обрабатываемого в нем шовного материала. Бактериостатический эффект повязок пропитанных 50 % раствором спирта с МПХ потенцируется за счет синергизма действия препаратов (33).
Собственные исследования антимикробной активности МПХ, выпускаемой на Архангельском Опытном Водорослевом Комбинате, выполнены на кафедре микробиологии Северного государственного медуниверситета под руководством заведующей кафедрой, д.м.н., профессора Т.А.Бажуковой. Антибактериальную активность проявляют спиртовые растворы МПХ в концентрации 6,5 г/л и 19 г/л, причем по мере возрастания концентрации активного вещества идет усиление активности. Водо- и жирорастворимые препараты антибактери-ального эффекта не оказывали. Концентрации МПХ в наших исследованиях и литературных источниках сопоставимы. В литературе приводятся данные об антибактериальной активности МПХ без указания процентного содержания активного начала (15,19,25,26), за редким исключением (33). По нашему мнению, объяснение расхождения данных антимикробной эффективности in vitro по сравнению с данными, полученными in vivo, лежит в механизме действия МПХ.
Биологически активные металлопорфирины (в том числе хлорофилл) выполняют свои функции только при ассоциации с белковыми и липидными молекулами (9). Антимикробная, противогрибковая и даже противовирусная активность препаратов из водорослей обеспечивается флавонами, с одной стороны, и резкой стимуляцией фагоцитарной защиты, с другой (14).
Другими словами, антибактериальный эффект in vivo, кроме собственно антибактериальной активности, обеспечивается стимуляцией фагоцитоза, что подтверждается нашими исследованиями. Активность иммуноцитов в свою очередь обеспечивается метаболической поддержкой, которую оказывает МПХ. In vitro этот синергизм МПХ и иммуноцитов отсутствует.
Таким образом, экспериментальные данные позволяют прогнозировать области применения МПХ в клинической практике ближайшего будущего:
ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА