Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему: Возможности изолированной перфузии тонкой кишки в коррекции ишемического/реперфузионного повреждения (экспериментальное исследование)
Автореферат диссертации по медицине на тему Возможности изолированной перфузии тонкой кишки в коррекции ишемического/реперфузионного повреждения (экспериментальное исследование)
КОРНЮШИН ОЛЕГ ВИКТОРОВИЧ
ВОЗМОЖНОСТИ ИЗОЛИРОВАННОЙ ПЕРФУЗИИ тонкой кишки В КОРРЕКЦИИ ИШЕМИЧЕСКОГО/РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
14.03.03 — Патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук
Работа выполнена на кафедрах факультетской хирургии и патологической физиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И; П. Павлова» Мин-здравсоцразвития РФ.
доктор медицинских наук профессор
доктор медицинских наук профессор
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор
Седов Валерий Михайлович
Власов Тимур Дмитриевич
Королев Михаил Павлович
Тюкавин Александр Иванович
Ведущая организация: Военно-Медицинская Академия им. С.М.Кирова МО РФ.
Защита диссертации состоится 2011 года в
часов на заседании диссертационного совета Д 268.090.05 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Минздравсоцразвития России (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Минздравсоцразвития России (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8).
Автореферат разослан « // »сентября 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцент
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы обусловлена сохраняющейся высокой госпитальной летальностью при всех видах острого нарушения мезентериального кровообращения, которая по данным разных авторов продолжает составлять от 60% до 90% (Савельев B.C., Спиридонов И.В., 1979; Yasuhara H., 2005; Vollmar В., Menger M.D., 2011). Большинство исследователей видит выход из ситуации в ранней диагностике и попытке восстановления кровотока в пораженном бассейне (Ivo G. et al., 2005; Хрипун А.И. и соавт., 2009; Romano N. et al., 2011). Восстановление кровотока запускает каскад реакций известных, как реперфузионное повреждение (Mazzoni М.С. et al., 1995; Vollmar В., Menger M.D., 2011). Несмотря на наличие ряда экспериментально обоснованных подходов к предотвращению повреждения кишки в условиях ишемии-реперфузии, ни один из них на сегодняшний день не внедрен в клиническую практику (Mallick I.H. et al., 2004; Vollmar В., Menger M.D. 2011). Одним из механизмов реперфузионного повреждения является быстрая нормализация осмолярности, приводящая к вымыванию осмотически активных веществ из интерстиция, что сопровождается формированием осмотического градиента между внутриклеточным и интерстициальным пространствами. Наличие осмотического градиента приводит к поступлению в клетку воды, повышению внутриклеточного давления и повреждению мембран (Shah S.К., Moore-Olufemi S.D. et al., 2010, Shah S.K., Fogle L.N., 2010). Одним из возможных направлений предупреждения ишемического и реперфузионного повреждения кишечника является применение гиперосмолярных растворов, что было показано в исследованиях на крысах в состоянии геморрагического шока, при котором также развивается ишемия кишки на фоне циркуляторных расстройств (Zakaria et al.,2007; Lu et al., 2008). Однако использование гиперосмолярных растворов при внутривенном введении имеет количественное ограничение и ряд недостатков. Возможность развития таких осложнений, как гипернатриемия, нарушение сердечного ритма, сердечная недостаточность, коагулопатия, гиперосмолярная кома требует поиска способа воздействия на ишемизированные ткани, по возможности минуя системный кровоток. Применение гиперосмолярных растворов для защиты тонкой кишки от реперфузионного повреждения после устранения острого нарушения мезентериального кровообращения не изучалось.
В последние годы внимание исследователей привлекает защитный эффект ишемического посткондиционирования, заключающегося в серии коротких эпизодов прекращения кровотока в самом начале реперфузионного периода. Поскольку данный феномен изучается с 2006 года, публикации, посвященные посткондиционированию кишки единичны (Santos D. et al., 2009, Bretz В. et al., 2010; Rosero O. et al., 2011). В немногочисленных исследованиях эффект посткондиционирования тонкой кишки на крысах изучен при сроках ишемии, не превышающих 30 мин (Santos D. et al., 2009, Bretz В. et al., 2010; Rosero O. et al., 2011). Клиническая же необходимость требует оценки
возможности защитного эффекта при ишемии более продолжительных периодов.
Наряду с поиском новых подходов лечения не меньшую актуальность имеет разработка методов ранней диагностики ишемических изменений в кишке. Учитывая отсутствие специфичных лабораторных маркеров ишемии кишки, одним из методов ранней ее диагностики может быть флуоресцентная органоскопия. Флуоресцентная органоскопия на основе аутофлуоресценции является особым направлением данных исследований, не требующим введения флуоресцентных препаратов. В то же время аутофлуоресценция дает возможность интраоперационной оценки метаболической активности, что коррелирует со степенью ишемии и может быть перспективной для диагностики (в плане диагностики). Данные по аутофлуоресценции кишки в условиях ишемии в литературе единичны и этот вопрос требует дальнейшего изучения.
Цель работы: исследовать влияние регионарной перфузии гиперосмо-лярными растворами и применения протокола посткондиционирования на состояние тонкой кишки в постишемическом периоде.
1. Разработать методику регионарной перфузии тонкой кишки крысы ex vivo и in vivo.
2. Исследовать эффективность защиты тонкой кишки от реперфузионного повреждения с помощью регионарной перфузии растворами разной осмо-лярности.
4. Изучить влияние растворов с различным ионным составом на состояние тонкой кишки при постишемической реперфузии.
5. Оценить защитный эффект посткондиционирования после 90-минутной ишемии тонкой кишки.
6. Определить в эксперименте возможность использования феномена аутофлуоресценции тонкой кишки для интраоперационной диагностики ее ишемии.
В настоящем исследовании впервые применена оригинальная методика регионарной перфузии тонкой кишки крысы гиперосмолярным раствором.
Произведена оценка эффективности применения перфузионных растворов с различной осмолярностью и электролитным составом. Впервые, на основании морфологических исследований и оценки функциональной активности кишки, выполненных в экспериментах ex vivo и in vivo, показан защитный эффект перфузии гиперосмолярным раствором осмолярностью 365 мосм/л, предваряющей восстановление кровотока. Впервые показан повреждающий эффект гиперосмолярного раствора осмолярностью 415 мосм/л с повышенным содержанием калия в условиях острой ишемии кишки.
Показан защитный эффект посткондиционирования в условиях реперфу-зионного повреждения тонкой кишки. Экспериментально подтверждена возможность ЫАОН-аутофлуоресценции, как способа интраоперациоиной оценки острой ишемии кишки.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты важны для дальнейших исследований в направлении совершенствования методик по защите тонкой кишки от реперфу-зионного повреждения. Разработана методика регионарной перфузии тонкой кишки в эксперименте. Полученные данные дают теоретическое обоснование проведения регионарной перфузии гиперосмолярным раствором в условиях острой ишемии тонкой кишки. Результаты проведенных экспериментов позволяют ответить на ряд вопросов касающихся интраоперациоиной защиты тонкой кишки в условиях реперфузионного повреждения и дают конкретные рекомендации относительно химического состава и осмолярности раствора, использовавшегося для регионарной перфузии тонкой кишки. Разработанная методика регионарной перфузии тонкой кишки гиперосмолярным раствором на основе буферного раствора Кребса-Хенселейта могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения. Показан защитный эффект посткондиционирования после 90-минутного ишемического повреждения тонкой кишки, что в силу простоты выполнения позволяет рекомендовать для клинического применения и дальнейшего изучения с целью выявления механизмов обуславливающих протективный эффект посткондиционирования. Произведена оценка феномена ЫАОН-аутофлуоресценции в условиях ишемии, полученные результаты позволяют рекомендовать данную методику для использования в клинической практике с целью интраоперациоиной оценки жизнеспособности тонкой кишки, в условиях нарушения кровообращения.
Личный вклад автора в проведенное исследование
Автор лично выполнил экспериментальную часть исследования, провёл анализ литературных данных, а также осуществил статистическую обработку результатов экспериментов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Введение посредством регионарной перфузии гиперосмолярных растворов оказывает защитный эффект при восстановлении кровотока в тонкой кишке, однако выраженность этого действия зависит от степени осмолярности растворов и их электролитного состава; повышение концентрации калия в гипе-росмолярном растворе усиливает тяжесть повреждения в стенке кишки.
2. Выполнение протокола посткондиционирования уменьшает реперфузион-ное повреждение тонкой кишки при восстановлении кровотока после ишемии.
3. NADH-аутофлуоресценция является методом, позволяющим проведение интраоперационной органоскопии в условиях ишемии/реперфузии тонкой кишки.
Основные положения работы доложены на VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 160-летию со дня рождения И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2009), на Медицинском форуме "Санкт-Петербург" - Гастро-2010", на межвузовских конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011), на 24th meeting of the European Intestinal Transport Group (EITG), 2011, Oxford, UK, на совместном заседании проблемной комиссии "Хирургия и онкология" и кафедр факультетской хирургии и патологической физиологии ГБОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова» Минздравсоцразвития РФ.
Внедрение результатов работы
Результаты и выводы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре патофизиологии с курсом клинической патофизиологии, в учебный процесс и лечебную работу клиники факультетской хирургии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Минздравсоцразвития РФ России (197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных перечнем ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 29 рисунков.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 12 отечественных и 196 зарубежных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
Эксперименты были проведены на 182 крысах-самцах массой 200-300 г линии Wistar. Все эксперименты были одобрены этическим комитетом ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Минздравсоцразвития России.
Экспериментальные модели ишемии-реперфузии топкой кишки
Опыты проводились ex vivo и in vitro.
Основные экспериментальные модели ишемии-реперфузии тонкой кишки ех vivo:
модель "вывернутого мешка" с воспроизведением аноксии/реоксигенации для оценки активного транспорта глюкозы;
модель перфузии изолированной тонкой кишки крысы с воспроизведением (глобальной) ишемии-реперфузии ex vivo;
Оценка активного транспорта глюкозы тонкой кишки крысы на модели "вывернутого мешка" ex vivo.
Для исследования всасывания веществ в работе использовалась модель "вывернутых мешков" в модификации Лаборатории физиологии питания института физиологии им.И.П.Павлова (Громова Л.В., 2006). Из стандартного участка тонкой кишки готовили вывернутые мешки тонкой кишки длинной 2,5-3 см, заполненные охлажденным раствором Рингера. Аноксия моделировалась путем помещения кишечных препаратов в течение 15 мин при 37°С в раствор Рингера в условиях насыщения азотом N2. Реоксигенация, проводилась в оксигенированном растворе Рингера (рН 7.27.4) в течение 90 мин. В части исследований первые 10 минут реоксигенации препаратов кишки производилась в гиперосмолярном растворе Рингера (400 мосм/л, рН 7,1-7,4).
Аккумуляцию глюкозы в серозной жидкости "вывернутых мешков" оценивали по количеству глюкозы, содержащейся в "мешке". Для определения пассивного транспорта глюкозы в раствор добавлялся ингибитор транспортера SGLT-1 флоридзин (0,5 мМ).
Препараты окрашивались гематоксилином и степень повреждения слизистой оболочки тонкой кишки оценивалась с помощью световой микроскопии с морфометрической обработкой в программе "VideoTest 4.0" ( ВидеоТесТ (Россия)). Для количественной оценки степени повреждения стенки кишки использовалась классификация Chiu C.J. at al. (1970).
Модель перфузии изолированной тонкой кишки крысы с воспроизведением ишемии-реперфузии ex vivo.
Тонкая кишка с сосудистой ножкой извлекалась и подключалась к модифицированному аппарату Лангендорфа. Перфузия изолированной кишки производилась через бассейны краниальной брыжеечной артерии и чревного ствола постоянным давлением 80 мм.рт.ст. буферным раствором Кребса-Хенселейта. Ишемия тонкой кишки (30 мин) воспроизводилась путем прекращения перфузии, а реперфузия - ее возобновлением в течение 30 мин.
Состав гипсросмолярных растворов.
Все использовавшиеся в эксперименте изолированной перфузии тонкой кишки крысы гиперосмолярные растворы являлись модификацией раствора Кребса-Хенселейта (315 мосм/л). Осмолярность используемых растворов была повышена либо на 50 мосм/литр, либо на 100 мосм/л. Использовались следующие варианты растворов (Таблица 1).
Составы гиперосмолярных растворов в ммоль/литр.__
КХ ГР-415 (Na) ГР-415 (Na+K) ГР-415 (Man) ГР-365 (Na)
Na+ 145,7 245,7 241,7 145,7 195,7
К+ 5,9 5,9 2j9 5,9 5,9
er 126,2 226,2 226,2 126,2 176,2
S04 2" 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
Ca 2+ 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
НСОЗ" 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0
Глюкоза 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
rP-415(Na) - осмолярность раствора повышалась за счет добавления 100 ммоль/л NaCl;
ГР-415(Ыа+К) - осмолярность повышалась за счет добавления 100 ммоль/л NaCl и KCl, в количестве пропорциональном исходному раствору Кребса-Хенселейта.
ГР-415(Мап) осмолярность повышалась за счет добавления 100 ммоль/л маннитола, как соединения не проникающего через клеточную мембрану; rP-365(Na) - осмолярность повышалась за счет добавления 50 ммоль/л NaCl для достижения осмолярности 365 мосмоль/л.
Методика оценки необратимого повреждения кишки.
При завершении эксперимента производилась гистохимическое исследование размеров необратимого поврежденной зоны стенки кишки. Основой данного метода является химическое взаимодействие
трифенилтетрозолия хлорида (ТТХ) с NAD-зависимыми ферментами цепи переноса электронов внутренней мембраны митохондрий (Fishbein М.С. at al., 1981). Окрашивание производилось путем внутриартериального введения 0,5% раствора ТТХ.
Полученные срезы-кольца кишки одинаковой толщины (1,5 мм) фотографировали цифровой камерой Olympus С-4000, сопряженной с микроскопом МБС-10 (JIOMO, Санкт-Петербург). Изображения срезов обрабатывали компьютерным методом, который позволяет рассчитать площадь окрашенных и неокрашенных зон.
Оценка спонтанной двигательной активности.
Оценка спонтанной двигательной активности осуществлялась с помощью меток, располагавшихся со стороны серозной оболочки на одинаковом расстоянии по отношению друг к другу. В ходе эксперимента посредством USB видеокамеры записывались видеофрагменты, фиксировавшие взаимное смещение маркировочных меток. Обработку видео проводили с помощью программы VirtualDub (Avery Lee, США). Посредством, специального программного обеспечения проводился анализ двигательной активности кишки.
Острая ишемия тонкой кишки крысы in vivo. с последующей реперфузией в острых экспериментах на анестезированных крысах in vivo.
Ишемия тонкой кишки продолжительностью 60 мин воспроизводилась по стандартной методике путем клипирования краниальной брыжеечной артерии на 60 мин или 90 мин, в зависимости от задач эксперимента, с последующим периодом реперфузии 30 мин.
Протокол посткондиционирования проводился после 90-минутной ишемии и состоял в создании четырех эпизодов 15-секундной остановки реперфузии, перемежающихся эпизодами восстановления кровотока на 15 сек (общее время - 2 мин). После посткондиционирования проводилось восстановление кровотока на 30 минут.
Оценка активности окислительных процессов с помощью аутофлуоресцентной органоскопии.
Одним из индикаторов, отражающих активность метаболичеекких процессов, является NAD, основной функцией которого является перенос энергии в цикле трикарбоновых кислот. В условиях аноксии в митохондриях клетки увеличивается количество его восстановленной формы - NADH, дающей свечение в видимом диапазоне при облучении ультрафи олетом (Esumi К., 1991).
Возбуждение аутофлуоресценции производилось специальным источником (Semrock Inc, USA) на длине волны 357±22 нм. Регистрация изображений в свете аутофлуоресцентной эмиссии осуществлялась с помощью установки с мультиспектральной видеосистемой, построенной на базе высокочувствительного RGB ПЗС детектора. Величина исходных показателей была принята за 100 отн. Ед. Обработка изображений и расчет интенсивности аутофлуоресценции проводились с использованием специальных программ.
Регионарная перфузия тонкой кишки in vivo
Регионарная перфузия тонкой кишки производилась посредством катетера введенного в аорту через бассейн краниальной брыжеечной артерии постоянным объемом (15 мл/мин). После завершения регионарной перфузии кровоток в мезентериальном бассейне и аорте восстанавливался. Для оценки влияния регионарной перфузии тонкой кишки на гемодинамические показатели на протяжении всего опыта производилось измерение артериального давления (АД) прямым способом.
Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного пакета SPSS Statistics 13.0. значимость различий измеряемых параметров оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок и критерии двух связанных выборок Уилкоксона. Значения Р менее чем 0,05 рассматривались, как значимые.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Результаты исследований на модели «вывернутого мешка» ex vivo.
Данная модель использовалась для оценки эффективности защитного влияния гиперосмолярного раствора на слизистую оболочку тонкой кишки в условиях аноксии. Аноксия в течение 15 мин достоверно снижала активный транспорт глюкозы (на 89 %, Р<0,05), но не влияла на ее пассивный транспорт (показатель, характеризующий диффузионную проницаемость кишечного эпителия в отношении глюкозы). Если после 15-минутной аноксии производилась инкубация препаратов в условиях нормальной оксигенации в стандартном растворе Рингера с осмолярностью 300 мосм/л, то дальнейшего снижения активного транспорта глюкозы не наблюдалось в течение 90 мин последующей инкубации.
Рис.1. Транспорт глюкозы в серозную полость вывернутых мешков гонкой кишки, подвергнутых аноксии в течение 15, при их последующей инкубации в течение 90 мин в условиях оксигенации в
модификациях раствора Рингера в присутствии глюкозы (10 мМ). По вертикали: уровень транспорта глюкозы (мкмоль/г ткани). Обозначения: 1 — в отсутствии флоридзина; 2 — в присутствии 0,5 мМ флоридзина. I — стандартный раствор Рингера (контроль); II — гиперосмолярный (400 мОсм) раствор в течение первых 5-10 мин; (М±т, п=6). * — р<0,05 по сравнению с транспортом в отсутствие флоридзина (непараметрический критерий G); ** — р<0,05 по сравнению с аналогичным показателем в контроле (непараметрический критерий G)
Инкубация препарата кишки в гиперосмолярном растворе (400 мОсм) в течение 10 мин после 15-минутной аноксии достоверно повышало (Р<0,05) активный транспорт глюкозы в условиях оксигенации, но не влияло на ее пассивный транспорт (рис. 1).
При гистологическом исследовании препаратов было отмечено, что 15 минутная аноксия приводила к некрозу поверхностного эпителия ворсинок с небольшими участками их тотальной деструкции. При реоксигенации отмечалось увеличение площади участков кишки с тотальной деструкцией ворсинок, вплоть до мышечной оболочки, что подтверждает значимость повреждения при реоксигенации. Применение гиперосмолярного раствора в постаноксическом периоде снизило степень повреждения и сопровождалось
достоверным уменьшением степени деструкции ворсинок эпителия тонкой кишки (Рис.2).
"I С 4ао Ш Ш л 5 степень
А15 А15Р15 А15Г15
Рис. 2. Тяжесть морфологического повреждения тонкой кишки крысы в условиях аноксии/реоксигенации и протекции от реперфузионного повреждения. Степень тяжести повреждения определена по классификации CJ Chiu (1970).
Обозначения: А15 - аноксия 15 минут; А15Р15 - аноксия 15 минут, реоксигенация 15 минут; А15Г15 - аноксия 15 минут, гиперосмолярный раствор Рингера 400 мосм/л - 10 мин, реоксигенация 5 мин; * — р<0,05 4-я степень по сравнению с группой аноксии-реоксигенации.
Таким образом, воздействие гиперосмолярного раствора 400 мосм/л на слизистую оболочку кишки в постаноксический период улучшает ее функциональное состояние (транспорт глюкозы) и уменьшает повреждение при реоксигенации.
Результаты исследований на модели перфузии изолированной тонкой кишки крысы с воснроизведеиием ишемии-реперфузии и применением гиперосмолярных растворов осмолярностью 415 моем ex vivo.
В данной сери экспериментов были исследованы три группы животных: 1. Контрольная группа для оценки качества методики перфузии. Перфузия тонкой кишки крысы производилась без воспроизведения ишемии стандартным раствором Кребса-Хенселейта (315 мосм/л) на протяжении 90 минут.
2. Ишемия-реперфузия. После 30-минутного стабилизационного периода воспроизводилась 30-минутная ишемия, после которой шел 30-минутный реперфузионный период стандартным раствором Кребса-Хенселейта.
3. Ишемия + гиперосмолярный раствор. Эксперимент проводился по протоколу группы №2, но в первые 5 минут 30 минутной реперфузии производились гиперосмолярным раствором.
В контрольной группе на протяжении всего эксперимента в течение 90 минут, а так же в течение 30 минут стабилизационного периода остальных групп скорость потока перфузируемого раствора в среднем составляла 25,9±0,45 мл/мин, оставаясь стабильной. В постишемический период (группа №2) происходило снижение скорости потока перфузата («мезентериальный кровоток») до 20,82±1,03 мл\мин что составило 82,45% от исходного. Применение всех вариантов гиперосмолярных растворов, осмолярностыо 415 мосм/л, также снизило показатели скорости «мезентериального кровотока». В группах с использованием гиперосмолярных растворов ГР415(Ыа), ГР-415(Мап) и ГР-415(ЫаК) «мезентериальный кровоток» снизился до 13,23±1,12 мл/мин, 15,4±1,38 мл/мин и 12,1±0,88 мл/мин что составило 52,4%, 61,3% и 48,9% от исходного, соответственно.
При гистохимическом исследовании были получены данные, что применение гиперосмолярных растворов ГР-415(1Ча) и ГР-415(Мап) достоверно не изменило площади повреждения по сравнению с экспериментами по протоколу №2 (ишемия-реперфузия). Использование раствора ГР-415 (Ыа+К) достоверно увеличило площадь повреждения до 28,51±4,61%, что практически в два раза превысило повреждение по сравнению с группой №2 (ишемия-реперфузия) (Рис. 3).
Рис. 3. Площадь необратимого повреждения при ишемии/реперфузии и при применении в постишемичесом периоде растворов с осмолярностыо 415 мосм/л. Обозначения: ИР - ишемия - 30 мин, реперфузия 30 мин; ГР-415(Na) - гиперосмолярный раствор с осмолярностыо 415 мосм/л за счет 100 ммоль/л NaCl; rP-415(Na+K) - гиперосмолярный раствор с осмлярностыо 415 мосм/л за счет пропорционального повышения NaCl и KCl; ГР-415(Мап) -гиперосмолярный раствор с осмолярностыо 415 мосм/л за счет 100 ммоль/л маннитола. * - р<0,05 по сравнению с группой ишемии-реперфузии.
Результаты исследований на модели перфузии изолированной тонкой кишки крысы с воспроизведением ишемии-реперфузии и применением гиперосмолярных растворов осмолярностью 365 моем ex vivo.
В группе с применением гиперосмолярного раствора TP-365(Na) скорость «мезентериального кровотока» достоверно не отличалась от таковой в группе ишемия-реперфузия (№2), и составила 18,99±1,56 мл\мин, что соответствовало 75,57% от исходного.
При окраске кишки ТТХ площадь необратимого повреждения в группе №2 (ишемия-реперфузия) достоверно составила 14,89±5,07% от общей площади (Рис№4). Использование в постишемическом периоде гиперосмолярного раствора Кребса-Хенселейта TP-365(Na) достоверно снизило площадь повреждения до 5,37±0,43% (Рис.4).
Рис. 4. Площадь необратимого повреждения при ишемии/реперфузии и при применении в постишемическом периоде раствора с осмолярностью 365 мосм/л. Обозначения: контроль - перфузия тонкой кишки 90 минут; ИР -ишемия -30 мин, реперфузия - 30 мин; ГР-365(№) - гиперосмолярный раствор с осмолярностью 365 мосм/л за счет 50 ммоль/л №С1. * - р<0,05 по сравнению с контролем, & - р<0,05 по сравнению с группой ишемии-реперфузии.
При гистологическом исследовании получены данные, что во всех препаратах группы ишемия-реперфузия отмечались изменения, соответствующие 3-й степени СЫи 0. (1970) - проявлявшиеся деструкцией кишечных ворсинок, паретическим расширением капилляров, умеренной лейкоцитарной инфильтрацией и выраженным отеком мышечной оболочки (См рис. 5).
Применение гиперосмолярного раствора ГР-365(№) достоверно уменьшало повреждение: в 50% препаратов структура ворсинок кишки
сохранялась, уменьшался отек мышечной оболочки, что соответствовало 2-й степени повреждения по классификации СЫи С.Г (1970).
Рис. 5. Выраженность тяжести морфологических изменений. Обозначения: ИР - ишемия/реперфузия; TP-365(Na) - перфузия гиперосмолярного раствора TP-365(Na) в постишемическом периоде перед реперфузией. * - р<0,05 по сравнению со 2-й степенью в группе ишемии-реперфузии, &- р<0,05 по сравнению с 3-й степенью группы ишемии-реперфузии.
При оценке частоты спонтанных сокращений тонкой кишки в контрольной группе было отмечено, что она составляла 16,2±0,15 Гц и оставалась стабильной весь период реперфузии. В постишемическом периоде (группа 2) в первые 15 минут реперфузии отмечалось увеличение частоты сокращений тонкой кишки до 27,6±0,18 Гц с последующим снижением частоты сокращений до 0,19±0,09 Гц к 30 минуте, что можно рассматривать как показатель ишемического/реперфузионного повреждения. 5-минутная перфузия кишки гиперосмолярным раствором ГР-365(Na) устраняла постишемическую гиперперистальтику тонкой кишки с сохранением частоты ее сокращений близкой к нормальной (18,4±0,11 Гц) в течение всего периода наблюдения.
Особенности аутофлуоресцентной органоскопии при ишемическом и реиерфузиониом повреждении тонкой кишки ex vivo
В условиях ишемии тонкой кишки отмечалось быстрое (5-6 с) нарастание ее NADH-аутофлуоресценции (Рис 6), которое превысило исходный уровень сигнала на 72%. Повышение уровня аутофлуоресценции сохранялось на всем протяжении ишемии продолжительностью 30 мин. При
возобновлении перфузии показатели NADH флуоресценции возвращались к
Начало Начало ишемии реперфуэии
Время перфузии, мин.
6. Изменение интенсивности аутофлуоресценции при ишемии-
реперфузии изолированной тонкой кишки.
Таким образом, полученные результаты позволили подтвердить феномен ЫАБН-флуоресценции, как объективный метод оценки острых изменений метаболической активности стенки тонкой кишки.
Результаты исследований на модели ишемии-реперфузии тонкой кишки крысы in vivo.
Для подтверждения эффективности регионарной перфузией тонкой кишки гиперосмолярным раствором в постишемическом периоде были проведены исследования in vivo. В этой серии экспериментов животные были разделены на две группы:
1. Контрольная группа: ишемия - 60 мин, реперфузия - 30 мин.
2. Опытная группа, в которой после 60-минутной ишемии восстановление кровотока в тонкой кишке предварялось проведением регионарной перфузии гиперосмолярным раствором TP365(Na) в течение 5 мин, после чего восстанавливался кровоток на 25 мин.
На протяжении эксперимента отмечалась стабильность гемодинамики. Начало и окончание эксперимента проходило на практически неизменных показателях среднего артериального давления (123,22±4,22 мм.рт.ст. в начале опыта и 114±6,28 мм.рт.ст. при окончании эксперимента). В период проведения регионарной перфузии гиперосмолярным раствором отмечалось повышение среднего АД на 22±3,46 мм рт. ст., что связано с клипированием аорты на время перфузии. После окончания регионарной перфузии у всех животных фиксировалось кратковременное снижение среднего АД до 88,42±4,83 мм.рт.ст., обусловленное восстановлением кровотока в аорте.
Во всех препаратах тонкой кишки общая структура органа была сохранена. В группе ишемии 60 мин и реперфузии 30 мин отмечался отек мышечной оболочки на всем протяжении, повреждение ее структуры слизистой оболочки в виде деструкции ворсинок, как в апикальной их части, так и в области кишечных крипт. Практически все изменения - 93,26±9,52%. соответствовали 4-й степени повреждения по классификации С1пи СЛ. (1970). Лишь 6,37±6,36% соответствовали 3-й степени повреждения.
Применение в начале постишемического периода гиперосмолярного раствора ГР-365(Ыа) способствовало уменьшению отека мышечной оболочки. Деструкция слизистой оболочки затронула только апикальную часть ворсинок. 4-й степени повреждения по классификации СЫи С.Ц1970). соответствовали 70,65±6,15%, 3-й степени 23,1±14,99%, и 2-й степени -6,37±8,83% (Рис.7).
N 2-я степень 3-я степень * 4-я степень
Рис. 7. Выраженность тяжести морфологических изменений. Обозначения: ИР - ишемия 60 мин, реперфузия 30 мин; ГР-365(Ыа) -регионарная перфузия гиперосмолярным раствором TP-365(Na) в постишемическом периоде перед восстановлением кровотока в течение 5 мин. * - р<0,05 по сравнению с 3-й степенью в группе ишемии-реперфузии, &- р<0,05 по сравнению с 4-й степенью группы ишемии-реперфузии.
Ишемическое-реперфузионное повреждение в условиях применения посткондиционирования в опытах ш vivo.
В данной серии исследований изучались 2 группы животных:
1. Контрольная группа: ишемия - 90 мин, реперфузия - 30 мин,
2. Опытная группа, в которой после 90-минутной ишемии проводился протокол посткондиционирования с последующей 30-минутной реперфузией.
В контрольной группе после 30-минутной реперфузии наблюдались тяжелые морфологические изменения, сопровождающиеся в части
препаратов деструкцией всей слизистой с множественными кровоизлияниями, без сохранения структуры желез, соответствующие максимальной 5-й степени повреждения по СЫи С.1 (1970).
В группе с проведением посткондиционирования повреждение было ограничено лишь деструкцией ворсинок с сохранением структуры слизистой оболочки (Рис. 7).
3 ° 30% «I 4-я степень
ишемия-реп рефузин постконди^ионирование
Рис. 7. Выраженность тяжести морфологических изменений. * - р<0,05 по сравнению с 5-й степенью в группе ишемии-реперфузии.
Таким образом, полученные результаты показывают, что посткондиционирование обладает защитным эффектом при реперфузии тонкой кишки после ишемии длительностью 90 мин.
1. Гиперосмолярный раствор осмолярностью 365 мосм/л на основе буферного раствора Кребса-Хенселейта, введенный посредством регионарной перфузии, уменьшает реперфузионное повреждение тонкой кишки крысы после 30 мин ишемии.
2. Гиперосмолярные растворы 415 мосм/л с концентрацией калия 5,9 ммоль/л не влияют на показатели реперфузионного повреждения, в то время как повышение концентрации калия до 9,9 ммоль/л приводит к увеличению повреждения тонкой кишки в постишемическом периоде.
3.Разработанная методика регионарной перфузии тонкой кишки гиперосмо-лярным раствором не влияет на системную гемодинамику, что позволяет применять ее в условиях острого нарушения мезентериального кровотока.
4. Воздействие раствора Рингера осмолярностью 400 мосм/л на слизистую оболочку тонкой кишки в постаноксическом периоде уменьшает повреждение кишки при реоксигенации.
5. Модифицированная методика окраски трифенилтетрозолием хлорида (ТТХ) коррелирует с результатами гистологического исследования и позволяет быстро производить оценку степени повреждения тонкой кишки в эксперименте.
6. Посткондиционирование в режиме четырех эпизодов по 15 секунд ишемии, перемежающихся 15-секундными эпизодами реперфузии при сроке ишемии 60 мин уменьшает реперфузионное повреждения тонкой кишки после 90-минутной ишемии, что может быть перспективно для использования его в клинической практике.
7. Феномен NADH-аутофлуоресценции при возбуждении длиной волны 357±22 нм позволяет интраоперационно оценивать уровень метаболической активности ткани тонкой кишки в условиях нарушения кровообращения.
1. Разработанная методика регионарной перфузии тонкой кишки гиперосмо-лярным раствором может быть рассмотрена как перспективный метод защиты кишки от реперфузионного повреждения в клинике.
2. Посткондиционирование тонкой кишки - эффективный способ защиты от реперфузионного повреждения после длительной (до 90 минут) ишемии и может быть предложен для рассмотрения к введению в лечебный алгоритм лечения острого нарушения мезентериального кровообращения.
3. Аутофлуоресцентная органоскопия, выполняемая посредством NADH-аутофлуоресценции, может быть рекомендована для введения в диагностический алгоритм при острой и хронической ишемии кишки для интраопераци-онной диагностики.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Смирнов Д. А., Коршошин О.В., Юдинских Ю.П. Методика изолированной перфузии краниальной (верхней) брыжеечной артерии крыс // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2004. - 4 (12). - С. 84-87.
2. Власов Т.Д., Коршошин О.В., Папаяп Г.В. Возможности аутофлуоресцентной органоскопии при ишемическом и реперфузионном повреждении тонкой кишки in vitro II Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2009. - Том 8, №2 (30). - С. 73-75.
3. Коршошин О.В., Громова JI.B., Груздков A.A. Действие гипоксии иа всасывание глюкозы в тонкой кишке и некоторые способы его коррекции // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2009. -Том
4. Коршошин О.В., Левицкий Б.И., Лифиц О.Д., Рубцова Е.М., Савельева К.В., Хапачева Е.А., Чудинова A.A. Ишемическая адаптация тонкой кишки в эксперименте // Вестник РГМУ. - 2001. -№ 2/17. - С. 50.
5. Смирнов Д.А., Власов Т.Д., Нутфуллина Г.М., Савельева К.В., Корнюшин О.В. Эндотоксемия при экспериментальной ишемии и реперфузии тонкой кишки у крыс // Медицинский Академический Журнал. - 2001. - №1 (приложение 1). - С. 65-66.
6. Смирнов Д.А., Корнюшин О.В. Микроциркуляторный кровоток в кишечной стенке при различных формах острой кишечной непроходимости // Новые технологии в хирургии, сборник научных трудов кафедры факультетской хирургии. -2004. -том 3. - Санкт-Петебург: Изд-во СПбГМУ. -С. 255-267.
7. Корнюшин О.В., Громова J1.B. Нарушение активного транспорта глюкозы в тонкой кишке крыс при аноксии и некоторые подходы в его коррекции // VII Всероссийская конференция с международным участием. - 2009. -Санкт-Петербург. - С. 212-213.
8. Корнюшин О.В., Громова Л.В., Нутфуллина Г.М., Швед Н.В. Структурно-функциональные изменения в тонкой кишке при кратковременной аноксии и подходы их коррекции // Материалы 12-го Международного СлавяноБалтийского научного форума. - 2010. - "Санкт-Петербург - Гастро-2010", СПб. - С. М47.
9. Korniushin О., Gromova L. "Structural and functional changes to the small intestine in short-term anoxia and approaches to their correction" // 24th meeting of the European Intestinal Transport Group (EITG). - 2011. - Oxford, UK. - P. 64.
Список основных обозначений и сокращений
АД - артериальное давление АТФ - аденозинтрифосфорная кислота ТТХ - 1, 2,3 - трифенилтетразолия хлорид ЧСС - частота сердечных сокращений
Подписано в печать 12.09.2011г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ №2219.