Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему: Фармакогностическое изучение чистеца крупноцветкового
Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фармакогностическое изучение чистеца крупноцветкового
На правах рукописи
ТАМКОВИЧ ТАТЬЯНА ВИТАЛЬЕВНА
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЧИСТЕЦА КРУПНОЦВЕТКОВОГО
15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Работа выполнена в государственном образовательном учрежден высшего профессионального образования «Пятигорская государственн фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранен и социальному развитию»
доктор фармацевтических наук, профессор Челомбитько Вячеслав Александрович
доктор фармацевтических ьаук, профессор
Денисенко Олег Николаевич
ГОУ ВПО Пятигорская ГФА Росздрава
кандидат фармацевтических наук, доцент Кичев Дмитрий Геннадьевич ГОУ ВПО «Северо-Кавказский государстве ный технологический университет»
ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится «13» марта 2008 г. в_часов на заседании Диссерта
онного совета Д 208 069 01 в ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Пятигорск, пр Калинина, 11)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорско ГФА Росздрава (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)
Автореферат разослан «_»_2008 г
Ученый секрегаоь диссертационного совета /Я/^'
доктор фармацевтических наук, профессор Е В Компанцева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Перед современной фармацевтической наукой стоит задача - увеличить поисковую работу по созданию новых эффективных растительных лекарственных препаратов В настоящее время в России, как и в большинстве других стран, большой процент взрослого населения страдает острой и хронической патологиями печени и желчевыводящих путей В связи со значительным распространением этих заболеваний, тяжестью их течения, наличием гепатотоксических свойств широко применяющихся синтетических препаратов, в настоящее время предпочтение отдается лекарственным средствам растительного происхождения
Отмеченная в последние годы тенденция к росту патологий желчевыводящих путей и постепенное истощение природных ресурсов традиционных желчегонных лекарственных растений (бессмертник песчаный, пижма обыкновенная, барбарис обыкновенный и др ) делают актуальным поиск новых сырьевых источников лекарственных средств для лечения заболеваний печени и желчевыводящих путей По литературным данным некоторые растения рода чистец (ч лекарственный - Stachys officinalis L., ч буквицецветный - S betonicaeflora Rupr и ч болотный - S palustris L ), сем яснотковые (Lamiaceae) в традиционной медицине многих стран, используются в качестве желчегонных средств и проявляют фармакологическую активность схожую с известным препаратом «Фламин» В конце 70-х годов на Украине из травы ч вздутого (S mflata Benth.) был предложен препарат «Стахихол», отнесенный к группе истинных холеретиков. Однако, из-за отсутствия достаточной сырьевой базы некоторых видов рода чистец и вследствие геополитических изменений, произошедших в последние годы, поиск новых растительных источников желчегонных средств продолжает оставаться актуальным
В этой связи наше внимание привлек интерес чистец крупноцветковый (Stachys macrantha С Koch), известный также как буквица крупноцветковая (Betónica macrantha С Koch) Наличие значительной надземной фитомассы по сравнению с другими випами чистепа и достаточная распространенность "а территории Северного Кавказа, прогнозируют перспективность его использования в качестве нового сы-
рья для получения лекарственных средств Однако, для внедрения в медицинску практику необходимы исследования по изучению химического состава его биолог чески активных соединений и разработке методов стандартизации сырья Поэто фармакогностическое изучение чистеца крупноцветкового является актуальной пр блемой для фармацевтической науки и практики Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования - фармакогностическое изучение травы чис ца крупноцветкового, разработка нормативной документации на сырьё (трава), ка потенциального источника получения БАВ, обладающих желчегонным и против воспалительным действием.
Для досчижения поставленной, цели необходимо было решить следующие з
1. Выявить характерные места произрастания и определить ориентировочны запасы сырья чистеца крупноцветкового в некоторых регионах Северног Кавказа, в Ставропольском крае и в Карачаево-Черкесской Республике
2 Изучить возможность интродукции чистеца крупноцветкового в ботаническо саду Пятигорской ГФА
3 Провести фитохимическое изучение травы чистеца крупноцветкового (поли фенольных соединений, иридоидов, эфирного масла, полисахаридов, органи ческих кислот, аминокислот, макро- и микроэлементного состава).
4 Изучить оптимальные условия извлечения флавоноидов из травы чистеца крупноцветкового и разработать методику их количественного определения
5. Выявить анатомо-диагностические признаки сырья (травы) чистеца крупноцветкового
6 Провести стандартизацию травы чистеца крупноцветкового, разработать нормативную документацию на данный вид сырья
7 Провести фармакологические исследования экстракта чистеца крупноцветкового
Научная новизна исследования Впервые были определены места произрастания и ориентировочные ресурсы травы чистеца крупноцветкового на Северном Кавказе (в Предгорном районе Ставропольского края и в Карачаевском районе Карачаево-Черкесской Республики) В Ставропольском фае (Предгорный район) эксплуатационный запас травы чистеца крупноцветкового составил 4,07 т воздушно-сухого сырья, а в Карэтаевском районе Карачаево-Черкесской Республики - 3,52 т воздушно сухого сьрья
В результате проведенных фитохимических исследований установлено содержание в траве ч крупноцветкового основных групп биологически активных соединений. эфирное масло, флавоноиды, дубильные вещества, оксиюричные кислоты, 1$'марины, иридоиды, полисахариды, аминокислоты, ранее в литературе не описанные для этого вида.
Методом ВЭЖХ в сырье чистеца крупноцветною го впервые идентифицированы и количественно определены шесть фенольных соединений флавоноиды (ги-перозид, дигидрокверцетан и изосалипурпозид), фенолокислоты (галловая кислота), кумарины (дикумарин и умбеллиферон) Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в траве чистеца крупноцветкового идентифицированы иридоиды гарпагид, гарпагидацетаг, аюгозид и аюгол
Впфвые изучен фракционный состав полисахаридного комплекса травы чистеца кру пноцветкового Обнаружены водорастворимые полисахариды (0,78-0,83%), пектиновые вещества(036-0,55%), гемицеллюпоза А (3/30-3,21%), гемицеллюлозаБ (2,45-3^6%).
Охарактеризованы свободные органические кислоты, которые представлены винной,лимонной и аскорбиновой кислотами
Методом газовой хромато-масс-спектроснопии (ГЖХ-МС) изучен состав эфирного масла чистеца крупноцветкового. Впервые идентифицировали 56 соединений, преобладающими компонентами эфирного масла чистеца кру пноцветкового являются сесквитерпеноиды, из которых доминирующими являются - <;-кадинен, Ь-
■ MiT.nm.nt /и 1 Г с О
•_____п.____Г 1 Т1 п П ЛПГ 1 1 Г»М 11 ---^ ------ГП 1 1
каламсьсь, 1 гч.-^! 1п^-^-икьсишцикии и]дидек<1-
3,7-диен, диэпицедрен-1-оксид, т-кадинол, а -кадинол, оксид кариофиллена, цио-£-а-бисабол ена эпо ксид, 6,] 0,14-три мешл-2-пентад еканон
Найдены оптимальные условия анализа флавоноидов - качественного (методом ТСХ) и количественного (методом дифференциальной УФ-спектрофотометрии) в траве чисгеца крупноцветноюго Изучена динамика содержания флавоноидов различных органах травы в зависимости от фазы вегетации Установлено, что мак симапьное количество флавоноидов накапливается в листьях и в траве в период цв тения — начало плодоношения, в соцветиях - во время цветения
Установлен аминокислотный состав, который представлен 14 аминокисло ми, 8 из которых, являются незаменимыми метаонин, треонин, гистидин, аргини лейцин, валин, фенил аланин, изолейцин.
Впервые изучен макро- и микроэлементный состав травы чисгеца крупно цветкового,представленный 24 элементами, из которых доминирующими являютс калий, кальций, кремний, магний, фосфор и железо
Проведена стандартизация сырья чисгеца крупноцветно во го с учетом совр менных требований предъявляемых к подлинности и качеству лекарственного р тигельного сьрья
Впервые проведены фармакологические исследования и установлена желч тонная, противовоспалительная и ранозаживляющая активность экстракта трав чисгеца крупной веткою го
Выявлена возможность использования нового вида отечественного сьрь травы чисгеца крупноцветкового для получения биологически активных со един ний, включающих флавоноиды, ьу марины, дубилшые вещества, иридоиды, фенол кислоты, эфирные масла, полисахариды, органические кислоты, аминокислоты, о ладающие желчегонным, противовоспалительным и рано заживляющим действием Для травы чисгеца крупноцветко во го разработаны методики качественного количественного анализа флавоноидов, иридоидов, дубильных веществ, органич ских кислот, эфирного масла, аминокислот и др соединений с использованием годовБХ, ТСХ , ВЭЖХ, ГЖХ-МС, спектрофотометрии
На основании и микроскопических исследований травы чистеца крупноцвет-kd во го выявлена совокупность анато мо-диагностических признаков, nt> которым можно проводить идентификацию его сырья
В результате проведенных ресурсных исследований определена ориентировочная урожайность травы чистеца крупноцветно но го и выявлены два района, пригодные для промышленной заготовки сьрья этого видана Северном Кавказе Выявлена также возможность выращивания в условиях культуры чистеца крупноцветкоюго наКМВ
Внедрение результатов исследования По результатам исследования биологической активности сухого экстракта травы чистеца крупноцветыового получен акт внедрен и я ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава (акт о внедрении от 15 июня 2007 г) Сухой экстракт рекомендован для дальнейшего углубленного фармакологического исследования
Подготовлена ФСП «Чистеца крупноцветно во го трава» (подтверждена актом внедрения от 19 июня 2007 г.), принятая ЗАО «Вифитех» (Россия), позволяющая использовать в дальнейшем траву чистсца крупноцветкового как новый вид сьрья для получения лекарственных прел aparro в желчегонного и противовоспалительного действия
Основные положения, выносимые на защиту
1 Результаты изучения химического состава травы чистеца кругшоцветнового физико-химическими методами
2 Результаты качественного и количественного определения флавоноидов в траве чистеца крупноцветкоюго с помощью предложенных методик.
3 Результаты ресурооведческих исследований травы чистеца крупноцветкового натерритории Карачаево-Черкесской Республики и Ставропольского края
4 Результаты изучения фармакологической активности экстракта травы чистеца крупноцветю вого
5 Нормы качества, необходимые для стандартизации травы чистеца крупноцветно во го
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом нф'чн исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтам ской академии Росздрава(номер государственной регистрации 01200112164)
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены на 60-й межреги нальной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтич ской продукции» (Пятигорск, 2005 г.) По материалам диссертации опубликовано 1 работ в том числе 2 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзоралитературы, описания объектов и методовисспедования, 4 глав собственных исследований,общих выводов, списка цишруалой литературы, включающего 250 источник)в, из которых 54 иностранных авторов, и приложения. Диссертация иллюстрирован а 32 рисунками и 43 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объект исследования — трава чистеца крупноцветкового, заготовленная в р личных районах Северного Кавказа (Предгорный район Ставропольского края и ранаевский район Каранаево-Черкесской Республики)
1 Изучение биологически активных соединений, содержащихся в траве чистеца крупноцветкового В результате исследования качественного состава БАВ травы чистеца круп цветкового установлено присутствие в ней фенольньк и тритерпеновых соединен ир идо ид о в, эфирного масла, полисахаридов, органических кислот, макро- и микр эл ементо в, амино кислот.
Методом ВЭЖХ изучен качественный и количественный состав фенолшых единений чистеца крупноцветкового. Впервые идентифицированы галловая кисло ИЗО сап илу рПОЗИД, ди ку мйрИН, ДИГИДрО КБсрЦсТИН, ГИПфОЗИД,у мбеллиффон (рюС 1
Рисунок 1 - Спектр ВЭЖХ фенольных соединений водно-спиртового (спиртэтиловый 70%) извлечения нз травы чистеца крупноцветиэвого Методом внутренней нормализации выявлено, что вфенольном комплексе преобладают у мбеллиферон (12,48%), галловая шепота (11,74%) и гиперозид (822%). Из полученньк данных также следует, что в фенол шом комплексе содержится высокая концентрация не идентифицированного вещества (21,93%). Результаты анализа фенольных соединений представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Фенольные соединения водно-спиртового извлечения из травы чистеца крупноцветкового,идентифицированные методомВЭЖХ
№ ' ¡аимснование вещества Содержание веществ в выделенной смеси, %
1 ке идентифицированное вещество 21,93
2 галловая к-та 11,74
3 ичосалипурпсиид 4,52
4 дикумарин 1,70
5 дигидрокверцетин 0,40
6 гиперозид 8,22
7 умбеллиферон 12,48
Количественное определение суммы флавоноидов в траве чисгеца крупноцвет-кового.проводили методомдифференциальной спектрофотометрии. Содержание су ммы флавоноидов в изучаемом объекте в пересчёте на гиперспид составило в среднем 1,10 %.
В различных органах травы чистеца крупноцветшвого изучена динамика наг коштения фиавоноидов(рис2).
- листья SN 1 -бутонизация 2-начало цветения
/ . " - Vpaea 3- цветение 4-начало плодоношения
Рксукок2 - Содфжание флавоноидов в различных органах травы ч. фупноцветшвого в зависимости от фаз вегетации При сравнении содержания суммы флавоноидов в траве чистеца крупноц:
швого в разные фазы вегетации, установлено, что наибольшее содержание сумм?
флавоноидов наблюдается в фазу цветения - начало плодоношения в листьях и
траве. Максимал ьное накопление фиавоноидов для соцветий характерно в фазу и ве
тения. В стеблях растения обнаружено наимск ыпсс количество флавоноидов.
Содфжание тритерпеновых соединений определяли также в фазу цветения начато плодоношения. Спектрофотометрическим методом установлено, что тритер пеновые соединения составляют 036-039%. Органические кислоты определял! титр и метрическим методом в пересчете на яблочную кислоту. Общее содержани| составило i ,08-i /4% (таблЗ).
Содержание полисахаридов (4 £7-5,49%) в сьрье определяли - гравиметрически. Методом пфманганато метрического титрования определяли дубильные веще-, ства. Их количество составило 2,40-3,20%.
Эфирное масло из травы чистеца крупноцветна вою получали Пфегонюй с во дяным паром по методу 2 ГФ XI издания. Качественный состав эфирного масла и количественное содержание в нём отдельных компонентов установлен методом га зожидкостной хроматографии на хромато-масс-спектрометре АТ-5973 SMART Компонентный состав идентифицирован сравнением времен удфживания пиков исследуемых веществ с до сто верными образцами.
Количественное содержание компонентовопределено методом нормировки при компьютерной обработке данных. Преобладающими компонентами эфирного масла чистеца крупноцветкового являются сесквитфпеноиды. Масс-спектры и структур-
ные формулы некоторых из них представлены ниже. Всего в составе эфирного масла идентифицировано 56 соединений.
40 ПО 180 ?50 3?0 390 (герЕЬ) ГйрЬ!Ьа!гпе, 1Д3.4,4а.5.8,8а-она hydra-7.fr,в!!1у
40 110 180 250 320 390 (татйЬ) СагуорЬу11епе охйе
40 80 120 160 200 240 (герНЬ) МарЬ«Па!епе, 1^,3,446^ 1-.у