Функциональные Всего Пробирная крови для измерения жизнеспособности микобактерий, используя Репортер-Gene меткой БЦЖ или M. Tb (БЦЖ Люкс / М. Tb Люкс)
Важно использовать бактерий в логарифмической фазе роста для цельной крови люкс анализы, то есть выросла за 48-72 часа до посева проб, а метаболической активности является субоптимальным, если либо прямо из морозильника или в стационарной фазе. До роста должны быть стандартизированы для серии экспериментов либо 48 или 72 часа, чтобы избежать изменчивости. На рисунке 1 показана кривая роста представителя культуры БЦЖ люкс. Время удвоения составляет около 24 часов, пока стационарная фаза будет достигнута.
Рисунок 1. Представителю кривая роста БЦЖ люкс более 96 часов в 7H9 средних и соотношение РОС и КОЕ.
Хотя РГ значения всегда коррелирует с CFU, число РГ соответствует одному КОЕ может варьироваться в зависимости от состава, который является, почему это хорошая практика, чтобы использовать те же замороженные запасы всей серии экспериментов, чтобы гарантировать последовательное множественности заражения ( МВД).
Таблица 1 показывает пример сырья дата время посева (T 0) и в 96 часов. Рост соотношения рассчитываются по формуле T 96 / T 0, но и другие промежутки времени, конечно, могут быть измерены. Это, однако, не рекомендуется использовать культурами более 96 часов, так как значительная гибель клеток происходит.
Таблица 1. Пример исходных данных на момент прививки (T0) и на 96 часов (T96) и расчетные соотношения роста с 3 взрослых доноров.
В зависимости от наличия антиген-специфической памяти ответы и, возможно, нейтрофилов, рост соотношения варьироваться между отдельными людьми, как показано ниже на рисунке 2 в крови у детей с и без ВИЧ-инфекции. В среднем, маленькие дети имеют более высокие темпы роста соотношения, чем взрослые, туберкулиновой пробы (TST) + ве лиц имеют более низкий рост, чем отношения TST-ве лиц, а также ВИЧ-инфицированные пациенты имеют высокий коэффициент роста из-за дефицита CD4 Т-клеток населения, одним из ключевых посредников клеточного иммунного ответа на микобактерии.
Рисунок 2 Интер-доноров изменчивости:. Рост отношения T 0 по сравнению с 96 часов для набора пациентов, в зависимости от основного ВИЧ-статуса.
Воспроизводимость роста отношения в течение времени показано на рисунке 3, в которой обобщены результаты от 64 доноров крови в два раза за период в 12 месяцев и от одного донора крови неоднократно для контрольных экспериментов. Возможные причины изменчивости могут быть изменения в микобактериальные сенсибилизации или изменчивость в пределах уровней принимающих цитокинов, как это наблюдается во многих биопробы.
Рисунок 3. () Одноместный доноров по 12 раз за 12 месяцев. (Б) несколько (64) доноров по 2 раза более 12 мonths.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
DiscussionБактерицидное анализов в контексте исследований проблемы туберкулеза, вакцина хорошо известны на животных моделях, где они применяются для отбора потенциально перспективных вакцин-кандидатов. Сокращение бактериальной нагрузки в различных функциях органов в качестве основной для чтения из иммуногенности.
Первое поколение человека бактерицидные тесты были разработаны с использованием макрофагов один, инфицированных M. туберкулезом. КОЕ служили главным считывание микобактериальные выживаемость после минимального времени 3 недели. Эти анализы полагались на подготовку РВМС, приверженцем моноцитов / макрофагов и лизису при заданных временных точках 1,2.
Как наше понимание более сложных взаимодействий между макрофагами и Т-клетки содержат M. туберкулез развивается, и разделение различных популяций клеток с использованием магнитных гранул в настоящее время это возможно, эти системы были модифицированы путем добавления Т-клетки обратно в анализы и измерения КОЕ 3,4,5. Некоторые из этих исследований использовали жить М. туберкулеза, но один из основных факторов, сдерживающих работы с М. туберкулеза в бактерицидных тестов является необходимость сдерживания объектов и тот факт, что КОЕ доступны только через 3 недели культуры. Кроме того, РВМС основе анализов требуется большое количество крови и до сих пор полагаются на КОЕ как считывания, которая занимает 3 недели.
Чтобы облегчить более быстрое чтение-аутов, основанный на метаболическую активность, новые тесты были разработаны. В этих анализов, метаболическая активность измеряется как соотносятся жизнеспособных микобактериальные и три различные системы были разработаны в последние 10 лет, используя либо урацил включения 4,5, репортер-гена меткой микобактерий 6-11 или радиометрической системы обнаружения через BACTEC / MDGIT бутылки 7,8.
Цельной крови люкс анализа является только анализ на сегодняшний день, который был успешно переведен в эндемичных по ТБ настройки и использовать у детей 9,10. Кроме того, ни другого анализа опубликовало данные внутри-доноров изменчивости за период времени.
Ограничение анализа люкс является ее зависимость от генетически модифицированных организмов и необходимостью культуры организма перед посевом. Однако из-за точного количественного организмов, можно рассчитать очень точно множественности заражения для каждой серии экспериментов и каждая партия, которая помогает сопоставимости и воспроизводимости. Инструкции должны быть внимательно следил в подготовке штаммов для достижения хорошей жизнеспособности запасов, что является необходимым для успешного выполнения теста. Так как анализ проводится на свежей крови, это срочные и хранения образцов в области не представляется возможным. В идеале, кровь нужно предоставить доступ в лабораторию в течение 4 часов. Можно было бы в будущем, чтобы еще больше сократить объем крови требуется, и наша лаборатория в настоящее время работаем над этим.
Учитывая низкую стоимость и применимость для малых выборок, это технически возможно интегрировать этот анализ в клинические испытания новых вакцин ТБ 10 или противотуберкулезных мероприятий 11. Это обеспечит дополнительную возможность оценить не только хозяин ответ на введение вакцины, как нынешняя практика с использованием массива иммунологических и молекулярных методов (например, проточной цитометрии, ELISPOT и микрочипов), но для добавления функциональных зачитал микобактериальных выживаемость после хозяин-патоген взаимодействия. Это обычная практика для оценки вакцин в доклинических исследованиях на животных моделях или с помощью бактерицидных анализы, основанные на сыворотке торможение для других инфекций, не полагаясь на клеточный иммунный ответ.