Изучение конъюгативной способности крупных плазмид из почвенных штаммов Bacillus subtilis Федорина Екатерина Александровна
Федорина Екатерина Александровна. Изучение конъюгативной способности крупных плазмид из почвенных штаммов Bacillus subtilis : Дис. . канд. биол. наук : 03.00.15 Москва, 2006 122 с. РГБ ОД, 61:06-3/906
Содержание к диссертации
1. Обзор литературы 8
1.1. Плазмиды Bacillus subtilis и других видов бацилл 8
1.1.1. Общая характеристика бациллярных плазмид 8
1.1.2. Свойства, определяемые генами мелких плазмид бацилл 9
1.1.3. Свойства, определяемые генами крупных плазмид бацилл 13
1.1.4. Репликация плазмид 17
1.1.4.1 Репликация по механизму катящегося кольца 17
1.1.4.2. Тета-тип репликации 18
1.2. Бактериальная конъюгация 24
1.2.1. Механизмы конъюгационных процессов у грамотрицательных микроорганизмов на примере F-фактора E.coli 24
1.2.2. Конъюгация у грамположительных микроорганизмов 28
1.2.2.1. Механизмы конъюгации у грамположительных бактерий 28
1.2.2.1.1. Структуры, вовлекаемые в процесс конъюгации 28
1.2.2.1.2. Сходство элементов конъюгативного аппарата с компонентами системы секреции IV типа 31
1.2.2.2. Конъюгативная мобилизация RCR плазмид 35
1.2.2.3. Конъюгативные транспозоны 37
1.2.2.4. Конъюгация у бацилл 39
1.2.2.4.1. Группа В. cereus 39
1.2.2.4.2. Группа В. subtilis 42
1.2.2.5. Конъюгация у других грамположительных микроорганизмов 44
1.2.2.5.1. Конъюгативиый перенос с участием плазмид широкого круга хозяев. Конъюгация у стафилококков, лактококков и других грамположительных микроорганизмов 44
1.2.2.5.2. Феромонзависимая конъюгация у энтерококков 46
1.2.2.5.3. Конъюгация у стрептомицетов 48
2. Материалы и методы 52
3. Результаты 60
3.1. Поиск и характеристика крупных природных плазмид в штаммах Bacillus subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области 60
3.1.1. Поиск крупных плазмид в штаммах B.subtilis .60
3.1.2. Сравнение обнаруженных крупных плазмид с минирепликоном плазмиды р19 из белорусской коллекции B.subtilis 66
3.1.3. Определение способности крупной плазмиды из штамма B.subtilis 1440 к мобилизационному переносу 66
3.2. Изучение конъюгативных способностей крупной плазмиды из почвенного штамма B.subtilis 19 67
3.2.1. Мобилизация мелких неконъюгативных плазмид 67
3.2.1.1. Изучение особенностей мобилизации pUBl 10 67
3.2.1.1.1. Определяющая роль р19 в мобилизации pUBllO 68
3.2.1.1.2. Изучение влияния протеиназы К на мобилизацию pUBllO 69
3.2.1.1.3. Кинетика переноса pUBllO при разных температурах 71
3.2.1.1.4. Мобилизационный перенос pUBllO при использовании различных штаммов B.subtilis 72
3.2.1.1.5. Перенос pUBllO в штаммы разных видов Bacillus 72
3.2.1.2. Мобилизация других неконъюгативных плазмид 73
3.2.1.2.1. Изучение переноса плазмид с сигма-типом репликации (рВСІб,
3.2.1.2.2. Изучение переноса плазмиды, имеющей тета-репликон 74
3.2.2. Изучение конъюгативного переноса собственно крупной плазмиды р19 78
3.2.2.1. Маркирование крупной криптической плазмиды р19 78
3.2.2.2. Частота конъюгативного переноса плазмиды pl9cat 81
3.2.2.3. Коныогативный перенос pl9cat при разных соотношениях донора и реципиента 83
3.2.2.4. Кинетика конъюгативного переноса pl9cat 83
3.2.2.5. Особенности переноса р19 при использовании в качестве партнеров при конъюгации различных штаммов B.subtilis . 85
3.2.3. Анализ мутантов р19 с нарушенной способностью к конъюгации. 87
3.2.3.1. Клонирование в клетках E.coli фрагментов р19, обуславливающих способность плазмиды к конъюгационному переносу 87
3.2.3.2. Идентификация фрагмента ДНК, соответствующего рЗ-102, в клонотеке фрагментов ДНК р19 89
3.2.3.3. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК р19 и ее анализ 91
4. Обсуждение результатов 94
Введение к работе
Изучение организации генома микроорганизмов предполагает комплексное исследование всех генетических детерминант, в том числе и внехромосомных генетических элементов.
Плазмиды часто несут гены, в определенных условиях дающие селективное преимущество содержащим их клеткам. Многие известные свойства бактерий могут определяться плазмидными генами: устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов, ультрафиолетовому облучению, синтез бактериоцинов и антибиотиков, способность к деградации органических и неорганических соединений или фиксации азота; плазмиды могут содержать острова патогенности с генами, определяющими вирулентность и синтез токсинов, или нести гены общего клеточного метаболизма. Плазмиды, несущие новую генетическую информацию, служат неиссякаемым источником изменчивости бактерий, активно участвуя в горизонтальном переносе генов. Роль горизонтального переноса генов в эволюции и экологии микроорганизмов трудно переоценить.
Конъюгация описана у многих видов бактерий и является, по-видимому, основным способом горизонтального переноса генов в природе. Возможен конъюгативный перенос плазмид между бактериями, принадлежащими к разным видам и родам. Конъ-югативная передача плазмид может происходить между представителями разных царств: классический пример - передача Т-ДНК Ті-плазмид Agrobacterium в клетки высших растений, возможен перенос между бактериями E.coli и дрожжами S.cerevisiae (Bates et al., 1998). Описана система, в которой плазмида передавалась в процессе конъюгации от E.coli к клеткам HeLa (Waters, 2001).
Широкое распространение определенных генов в результате горизонтального переноса, безусловно, оказывает заметное влияние и в области практической деятельности человека. Быстрое распространение устойчивости к антибиотикам за счет конъюгации создает серьезные проблемы для медицины, как и распространение генов, обуславливающих вирулентность и продукцию токсинов. С другой стороны, все большее внимание привлекает возможность использования обусловленной плазмидами способности бактерий к биодеградации веществ различного происхождения, а также способности продуцировать биологически активные вещества. Bacillus subtilis является вторым по значимости (после Е.соїї) объектом бактериальной генетики и физиологии и классической моделью при изучении грамположи-тельных микроорганизмов. В настоящее время это наиболее изученный вид грамполо-жительных бактерий. Для B.subtilis 168 была определена полная нуклеотидная последовательность генома (Kunst et al., 1997). Особенности, выявленные в организации генома Bacillus subtilis, имеют существенное теоретическое и прикладное значение и позволяют рассматривать этот вид в качестве перспективного объекта генетической инженерии, способного конкурировать с классическим объектом E.coli. B.subtilis экологически безопасна: она исходно не патогенна, и организм человека не является для нее постоянным хозяином. Как и другие бациллы, B.subtilis секретирует белки в культуральную среду и служит важным промышленным объектом для получения различных ферментов. Одной из старейших областей применения B.subtilis является ферментация соевых бобов для получения "натто" (соевый сыр или творог) в японской пищевой промышленности. Бациллы применяются и в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных ДНК и продукции в их клетках ряда белков. Что немаловажно, бактерии B.subtilis не требовательны к условиям роста.
Лабораторный штамм B.subtilis 168 плазмид не содержит, до недавнего времени считалось, что основным способом горизонтального переноса генов у B.subtilis является трансформация. Хотя известно, что в природных штаммах B.subtilis встречаются крупные плазмиды, среди которых есть конъюгативные, конъюгация у этого вида микроорганизмов почти не изучена.
Целью работы являлось изучение особенностей конъюгации, осуществляемой крупными плазмидами природных штаммов Bacillus subtilis. В задачи исследования входило:
Поиск крупных плазмид в природных штаммах B.subtilis.
Изучение особенностей конъюгативной мобилизации мелких неконъюгативных плазмид, определяемой крупной плазмидой из природного штамма B.subtilis
Маркирование крупной конъюгативной плазмиды и изучение особенностей ее конъюгативного переноса, т.е. собственно конъюгации
Клонирование и секвенирование фрагментов ДНК конъюгативной плазмиды, содержащих гены, влияющие на процесс конъюгации.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Плазмиды Bacillus subtilis и других видов бацилл 1.1.1. Общая характеристика бациллярных плазмид
Бактерии рода Bacillus - аэробные, образующие эндоспоры, грамположительные палочки. Род Bacillus - это одна из наиболее разнообразных и коммерчески полезных групп микроорганизмов. Представители этого рода широко распространены в природе. Разнообразие метаболических процессов и низкая патогенность видов Bacillus послужили причиной широкого использования представителей этой группы в различных областях промышленности, а также в качестве объектов лабораторных исследований. В штаммах разных видов Bacillus довольно часто встречаются плазмиды. Они были обнаружены при исследовании бацилл многих видов, включая B.brevis (Dobritca et al., 1978), B.cereus (Bernhard et al., 1978; van Elsas, Pereira,1986), B.anthracis (Uchida et al.,1985; Uchida et al., 1986); B.licheniformis (Polak, Novick, 1982; Yoshimura et al., 1983; van Elsas, Pereira,1986; Parini et al., 1991), B.megaterium (Carlton, Helinski, 1969; Carlton, Smith, 1974; Yoshimura et al., 1983; van Tersch, Carlton, 1983), B.pumilus (Lovett, 1973; Lovett Bramucci,1975; Yoshimura et al., 1983), B.sphaericus (Polak, Novick, 1982; Yoshimura et al., 1983), B.stearothermofilus (Bingham et al.1979; Imanaka et al., 1981; Hoshino et al., 1985; de Rossi et al., 1989), B.circulans (Yoshimura et al., 1983), B.thuringiensis (Yoshimura et al., 1983; Baum, Gonzales, 1992; Andrup et al., 1994), B.amyloliquefaciens (Yoshimura et al., 1983), B.subtilis (Bernhard et al., 1978; van Elsas, Pereira,1986; Lovett, Bramucci, 1975; Polak, Novick, 1982; Tanaka, Koshikawa, 1977; Uozumi et al., 1980; Yoshimura et al., 1983; Полуэктова и др., 1996) и др.
В зависимости от вида природные штаммы, несущие плазмиды, могут составлять от 10 до 70%, а у B.thuringiensis почти 100% штаммов содержат плазмиды (Baum, Gonzalez, 1992). У B.subtilis плазмиды несут от 20 до 65% природных штаммов (Незаметдинова и др., 1992; Titok et al., 2003), хотя наиболее известный и изученный лабораторный штамм B.subtilis Marburg (или B.subtilis 168) плазмид не содержит (Kunst et al., 1997).
Плазмиды бацилл заметно различаются по молекулярной массе (от 1,1 МДа до 120 МДа) и размеру (от 1-2 тпн до 300 тпн). Нередко используют условное деление на мелкие плазмиды - до 10 тпн, и крупные - более 30 тпн. Именно такие плазмиды встречаются наиболее часто (Tanaka, Koshikawa, 1977; de Rossi et al., 1989; Parini et al., 1991; Baum, Gonzales, 1992).
Крупные и мелкие плазмиды отличаются по способу репликации. Подавляющее большинство мелких плазмид реплицируются по механизму катящегося кольца (rolling circle replication - RC). Крупные плазмиды используют так называемый тета-тип репликации, характерный и для репликации хромосомной ДНК (см. ниже).
В зависимости от размеров природные плазмиды представлены от 1-2 до 100-200 (рТНТ15 B.stearothermofilus) копий на клетку (Hoshino et al., 1985). Крупные плазмиды обычно представлены в клетке одной копией. Плазмиды до 10 тпн величиной, имеющие у бацилл в среднем 4-10 копий на хромосомный эквивалент, также считаются малокопий-ными. Копийность является важным фактором стабильности плазмиды. Как правило, многокопийные плазмиды гораздо менее стабильны, чем малокопийные.
Некоторые штаммы бацилл одновременно содержат несколько плазмид. У B.subtilis в одном штамме нередко сосуществуют две плазмиды разного размера и типа репликации. Одновременное присутствие в клетке двух мелких или двух крупных плазмид встречается реже. Сложный плазмидпый профиль характерен для B.thuringiensis: у некоторых штаммов на клетку приходится до 17 плазмид разного размера (от 2 до 250 тпн), что составляет 20-25% всей ДНК клетки (Lereclus et al., 1982). Большинство штаммов B.megaterium содержат более четырех разных плазмид (Vary, 1994; Stevenson et al., 1998).
1.1.2. Свойства, определяемые генами мелких плазмид бацилл
Большинство изученных бациллярных плазмид являются криптическими (не определяют заметных свойств бактериальной клетки), однако отдельные плазмиды из природных штаммов бацилл имеют селективные генетические маркеры.
В штаммах В. stearothermofilus были найдены плазмиды, гены которых определяют продукцию бактериоцинов: pSE410 (Stahl, 1991), рРЫО (М.м. 4,4 МДа) (Lovett et al., 1976). Показано, что плазмиды могут влиять на спорообразование клетки-хозяина (Lovett et al., 1973). В другой работе наличие плазмиды рІМІЗ (2,2 тпн) в клетках B.subtilis обеспечивало их нормальную споруляцию при низких и высоких температурах (30 и 40С) (Mahler, Halvorson, 1980).
Некоторые плазмиды несут гены устойчивости к антибиотикам. Несмотря на многочисленные исследования штаммов различных видов бацилл, целью которых был поиск новых плазмид, несущих детерминанты антибиотикоустойчивости, таких плазмид известно немного. Ряд штаммов бацилл, устойчивых к тетрациклину, выделили из почвы Полак и Новик (Polak, Novick, 1982). Резистентность к антибиотику обеспечивалась присутствием плазмид, сходных с рВС16 Tc R (B.cereus) и рАВ124 Tc R