Современные методы полногеномного секвенирования (расшифровки) ДНК в диагностике и лечении заболеваний
Технологии ДНК-секвенирования, появившиеся благодаря работам ученых Уолтера Гилберта (Maxam A, Gilbert W, 1977) и Фредерика Сенгера (Sanger F, Coulson A, 1975) в 70-х годах прошлого века перевернули наше понимание о человеческой биологии.
Непрерывное совершенствование этих технологий привело к тому, что проект по секвенированию человеческого генома, „Геном человека“ (Human Genome Project, HGP), был реализован за один год в 2001 году после десяти лет работы (Watson J, 1990; Venter J, et al, 2001). Ожидается, что секвенирование генома (sequencing, считывание информации с ДНК) предоставит человечеству преимущества в понимании здоровья людей и позволит перейти к индивидуальному лечению. В процессе секвенирования генома (или полногеномного секвенирования, wohle genome sequencing) исследователь или клинический специалист получает информацию о всей ДНК, находящейся в 23 хромосомах клеток человека, которые содержат примерно 3 млрд. пар нуклеотидов. Эта информация включает последовательности всех генов ( 20 тыс.) и некодирующих участков (которые составляют большую часть генома человека и участвуют, в частности, в регуляции работы генов; однако функции некодирующей части генома еще только предстоит узнать). Таким образом, в результате одного исследования (секвенирования) генома возможно получить гигантский массив информации, который будет использоваться в клинической практике, как с уже имеющимися данными, так и с данными, которые учёные будут получать по мере научного прогресса в будущем.
Последние 20 лет доминирует автоматизированное секвенирование по методу Сенгера. Этот метод был использован в глобальных проектах по секвенированию генома человека, различных животных, бактерий и вирусов. Однако данный метод оказался не подходящим для быстрого рутинного секвенирования человеческих геномов в клинических целях. Поэтому появилась необходимость в изобретении новых технологий полногеномного секвенирования. Автоматизированное секвенирование по Сенгеру считается "методом первого поколения", тогда как современные методы называются "методами нового, или второго, поколения" (Next-Generation Sequencing, NGS). В основе этих технологий находятся различные стратегии, основанные на уникальных комбинациях приготовления ДНК-матриц, секвенирования, визуализации, а также выравнивания и составления последовательностей (sequences или "сиквенсов") ДНК (Metzker M, 2010). Основным преимуществом секвенирования нового поколения является рентабельность продукции огромного массива данных за короткое время. Индивидуальное геномное секвенирование – это быстрорастущая область технологии и медицины. Как ожидается, существенный прогресс последних лет в секвенировании в скором времени может привести к уменьшению стоимости секвенирования до 1000 долларов на индивидуальный геном (Service, 2006). В добавление к персональному полногеномному секвенированию, достижения в изучении однонуклеотидных полиморфизмов (single-nucleotide polymorphism, SNP) позволили генотипировать большинство вариаций в индивидуальных геномах. Несколько компаний уже предлагают индивидуальное секвенирование и генотипирование, а также информацию о персональной родословной. В ближайшем будущем пациенты смогут принести информацию о собственном геноме для того, чтобы врач смог оценить риски заболеваний и скорректировать стратегию лечения.
Клиническое применение полногеномного секвенирования
Традиционно медики основывают свои заключения в результате наблюдений, в том числе за симптомами заболеваний. Однако традиционные методы не всегда являются наиболее эффективными, так как каждый пациент имеет уникальные генетические особенности. Возможности, появившиеся благодаря развитию медицинской генетики, позволили более детально понимать влияние генетических особенностей и факторов на процессы заболеваний (Ku et al, 2010). В ходе полногеномных исследований в последние годы было идентифицировано несколько сотен риск-факторов для таких заболеваний, как рак, атеросклероз и других (Manolio et al, 2008). Открытие и изучение этих факторов позволит глубже узнать природу заболеваний и создать новые стратегии лечения и предотвращения заболеваний. Большое множество генетических вариаций у людей было идентифицировано в ходе глобального проекта „Геном человека“ по описанию общего паттерна генома человека (HapMap, совместный проект ученых Японии, Великобритании, Канады, Китая, Нигерии, США) и секвенирования индивидуальных геномов (Ku et al, 2010). Новейшие эффективные средства детекции генетических вариаций позволили лучше понимать индивидуальные различия и начать эру персональной, или индивидуальной, медицины.
Персональная медицина получила быстрый рост эффективности как в определении заболеваний, так и в предотвращении назначений некорректных лекарств, так как здесь необходимо основываться на индивидуальной клинической и генетической информации. Основная цель персональной медицины – это оптимизация и улучшение качества оказываемой медицинской помощи для каждого пациента. Для достижения этой цели потребуется развитие мультидисциплинарной медицинской системы, которая бы объединяла специалистов разных направлений, а также поднимала образовательный уровень врачей и пациентов в области индивидуального предотвращения, обнаружения и лечения заболеваний. Для этого, например, была образована Персональная Медицинская Коалиция (Personalized Medicine Coalition), некоммерческая организация зонтичного типа, состоящая из фармацевтических, биотехнологических, диагностических, информационно-технологических компаний, медицинских центров, государственных организаций, крупных академических институтов и т.д. Персональная Медицинская Коалиция способствует продвижению персональной медицины в широкую клиническую практику (Abrahams et al, 2005).
Кроме информации о генетическом коде, персональная медицина нуждается в интеграции данных производных генома: транскриптом (совокупность транскрибируемых РНК), протеом (совокупность синтезируемых организмом белков) и метаболом (совокупность всех метаболитов, являющихся конечным продуктом обмена веществ в организме).К окончанию создания последовательности референтного генома человека были открыты вариации в последовательности геномов среди индивидуумов, которые оцениваются в количестве 10-15 млн. К тому же, огромное множество редких вариантов представлено у нескольких индивидуумов, которые возможно узнать, применяя только полногеномное секвенирование (Heikes et al, 2008). Различия в геноме могут иметь разные эффекты на экспрессию генов. Не менее 500 маркеров заболеваний были недавно идентифицированы в полногеномных исследованиях, несколько из них связаны с мРНК и экспрессией протеинов (Hawkins et al, 2010). Во время перехода от здоровой стадии к стадии заболевания существует множество временных точек, в которых можно применить знания геномной информации. Восприимчивость к болезни и риск развития заболевания могут быть измерены и определены количественно при доступе к ДНК-информации. Такой способ может быть рентабельным в случае, если существующая модель поддержания здоровья людей изменится от лечения заболевания в сторону его предотвращения.
Также полногеномное секвенирование может быть использовано для идентифицированния типов заболеваний, которые невозможно диагностировать традиционными методами. Например, полногеномное секвенирование было использовано для идентификации нового субкласса лимфомы Буркитта из диффузной В-клеточной лимфомы до открытия самого этого класса (Dave et al, 2006).Таким образом, в обозримом будущем, геномная информация может предопределять как фенотипы болезни, так и терапевтические стратегии.
Рак и генетическая диагностика
Рак является существенной причиной смертности населения в развитых странах (Siegel et al, 2012). Геномный профиль, ассоциированный с развитием рака, имеет комплексную природу. Множественные изменения, возникающие при различных типах рака, включают: мутации, транслокации, изменение копийности генов, хромосомные перестановки, а также 5 эпигенетические изменения (Beroukhim et al, 2010; Verhaak et al, 2010; Berger et al, 2011; Stransky et al, 2011). Ранние исследования с использованием кариотипирования (анализ хромосом) и ДНК-микрочипов (анализ определенных генов) позволили узнать важнейшие данные о структурных изменениях в геноме, связанных с различными типами раковых заболеваний. Использование ДНК-секвенаторов нового поколения для полногеномного секвенирования раковых геномов может привести к кардинальным подвижкам в понимании возникновения рака (Shah et al, 2009). Наши знания о молекулярных механизмах рака начались с популяционных исследований семей, имеющих предрасположенность к раковым заболеваниям. Например, исследования семей с предрасположенностью к раку молочной железы позволили выявить мутации в генах BRCA1 и BRCA2 (Ford et al,1998). В женском организме мутации в генах BRCA1 или BRCA2 повышают риск развития рака груди и яичников (Huang and Huang, 2009; Wiesner et al, 2009). Поэтому женщинам, которые имеют эти заболевания в семье, рекомендуется проходить генетические тесты на мутации в генах BRCA1 и BRCA2 для диагностики предрасположенности, пока они здоровы. В случае положительного результата теста они должны периодически наблюдаться у врача. В ходе других популяционных исследований была найдена связь между мутациями в генах MLH1 и MSH2 и высоким риском возникновения рака кишечника (Gille et al, 2002). Людям, близкие родственники которых заболевали раком кишечника, рекомендуется пройти генетический тест на мутации в генах MLH1 и MSH2, которые повышают риск развития рака кишечника на 60% (Wiesner et al, 2009). В настоящее время количество генетических мутаций, ассоциированных с возникновением рака, постоянно растет. Несмотря на очевидную пользу популяционных исследований, они дают ограниченный объём информации для понимания молекулярных основ рака (Seng and Seng, 2008).
Традиционно, большинство исследований рака фокусируется на каком-либо одном гене или сигнальном клеточном пути. Однако рак имеет комплексную природу: в процессе развития участвует несколько клеточных сигнальных путей. Поэтому необходимо исследовать глобальные уровни экспрессии генов и сигнальных путей в контексте возникновения новообразований. Повторюсь, что данные обо всей последовательности генома, полученные с помощью технологий ДНК-секвенирования нового поколения, могут стать неоценимым источником информации для будущих врачей и патологов. Также, подобная информация поможет выяснить комплексную картину возникновения и эволюции рака (Chapman et al, 2011; Stransky et al, 2011; Shah et al, 2009; Schweiger et al, 2011; Welch et al, 2011). Недавно созданные глобальные консорциумы такие, как Атлас Ракового Генома (Cancer Genome Atlas, TCGA, find the link) и Интернациональный Раковый Консорциум (International Cancer Genome Consortium, ICGC), секвенировали тысячи раковых геномов и создали базы данных об изменениях в различных подтипах рака для свободного использования всеми специалистами и врачами мира.
В настоящее время в коммерческих целях используются, хотя и ограниченном количестве такие панели биомаркеров, как 21-генный OncotypeDX (Genomic Health) и 70-генный Mammaprint gene expression array (Agendia) тесты. Они используются для оценки риска рецидивов рака и принятия решения применения и/или коррекции химиотерапии при лечении рака молочной железы. Однако данные полногеномного секвенирования, полученные с помощью секвенаторов нового поколения, позволяют получить информацию о тысячах генов одновременно. Это многократно увеличивает достоверность показателей и прогноза заболевания по сравнению с действующими тестовыми системами, рассчитанными на исследование десятков генов. С развитием алгоритмов обработки данных, компьютерной техники и методов секвенирования полногеномный анализ может заменить существующие генетические тестовые системы (OncotypeDX и Mammaprint).
Другие заболевания и генетическая диагностика
Болезнь Альцгеймера – одна из самых распространенных причин старческого слабоумия у людей старше 65 лет, которой подвержены десятки миллионов людей во всем мире. Существенным генетическим фактором, повышающим риск этого заболевания (примерно в 11 раз), является аллельный вариант ε4 гена APOE (Kim et al, 2009). Генетический анализ, направленный на обнаружение данной аллели, может помочь диагностировать болезнь на ранних стадиях или принять профилактические меры в целях предотвращения развития болезни Альцгеймера задолго до возможного появления клинических симптомов. Недавние исследования выявили мутации также и в других генах (CLU, PICALM, CR1, MS4A, CD2AP, CD33, BIN1, TOMM40 и ABCA7), которые способствуют развитию болезни Альцгеймера. Таким образом, стандартный генетический тест на мутацию только в гене APOE может предоставить не полную клиническую и диагностическую информацию. В этом случае полногеномное секвенирование является более предпочтительным и информативным (Roses et al, 2010; Hollingworth et al. 2011; Naj et al, 2011). Наследственный фактор существенно влияет на возникновение сахарного диабета 1 типа (порядка 72-88%). В этом случае, подобное означает, что генетические факторы вносят больший вклад, чем факторы окружающей среды. Были выявлены мутаций (rs9272346, s9273363) в HLA регионе генома, в котором представлены гены иммунной системы. Их наличие значительно повышает шанс на приобретение сахарного диабета 1 типа (Nejentsev et al, 2007; Wellcome Trust Case Control Consortium, 2007).
Однако генетические факторы повышают риск развития сахарного диабета второго типа всего 26% и в этом случае образ жизни, экология и другие окружающие факторы играют более существенную роль в данном заболевании. Впрочем, наличие определенной мутации в гене TCF7L2 значительно повышает риск возникновения особого диабета 2 типа у беременных женщин (Grant et al, 2006; Shaat et al, 2007). Генетическая диагностика у девушек еще до наступления беременности может предотвратить заболевание. Будущие мамы должны изменить образ жизни, нормализовать вес, повысить физическую активность и следовать предписаниям врачей на основе генетической информации. Подобные изменения в образе жизни станут осознанными действиями с их стороны.
Примерно 15% супружеских пар подвержены бесплодию. Около половины из этих случаев приходится на мужчин. Пониженная концентрация сперматозоидов, или азоспермия, является причиной мужского бесплодия в 20%. Несколько мутаций в регионе AZF хромосомы Y ассоциируются с данным типом бесплодия, что позволяет провести генетическую диагностику на наличие данного заболевания (Hu et al, 2011). Желчнокаменная болезнь - одна из самых распространенных болезней в развитых странах (10-20%). Наследственная форма этой болезни связана с мутацией D19H в гене ABCG8, переносчика холестерола, находящегося в клетках желудочного тракта (Renner et al, 2013). Присутствие генетического варианта D19H в гене ABCG8 коррелирует с наличием камней в желчном пузыре. Риск развития заболевания среди носителей данной мутации в 3 раза выше по сравнению с носителями нормального типа гена. Генетический тест позволяет диагностировать наследственную форму желчнокаменной болезни даже в раннем возрасте.
Фармакогеномика и полногеномное секвенирование
Фармакогеномика (pharmacogenomics) использует геномные методы для понимания эффекта генотипа релевантных генов как на метаболизм лекарственных средств в организме, так и эффектов лекарственных средств на экспрессию генов. Фармакогеномика – это область исследований, которая применяет знания специфических генетических вариаций для обеспечения индивидуального подхода к назначению и дозированию лекарств. Одним из самых ярких примеров применения фармакогеномики является лечение варфарином (Voora et al, 2005). Оральный антикоагулянт варфарин прописывается для долговременного лечения и предотвращения тромбоэмболии.
Например, только в США варфарин прописывается более 21 млн. пациентам. Однако с применением варфарина связаны различные осложнения даже после коррекции дозы в зависимости от возраста, пола, веса, заболевания и диеты. Превышение или занижение дозы варфарина приводит к внутренним кровотечениям или закупорке вен, соответственно. Исследования фармакокинетики и фармакодинамики варфарина позволили установить влияние двух генов на его действие в организме. Один из этих генов, CYP2C9, ответственен за клиренс (около 80%) фармакологически активного S-энантиомера варфарина. Существуют три аллельных варианта CYP2C9 1, 2 и 3. Была обнаружена десятикратная разница в клиренесе варфарина у индивидуумов с разными аллелями данного гена. Второй ген, в котором вариации влияют на эффективную дозу варфарина - ген комплекса 1 витамин К эпоксид редуктазы (VKORC1). Комбинации вариаций в генах CYP2C9 и VKORC1, а также возраст и вес связаны с дозированием варфарина. Американское Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (Food and Drug Administration, FDA) признала важность проведения генотипирования генов CYP2C9 и VKORC1 в процессе лечения варфарином. В августе 2007 были внесены соответствующие изменения в описаниях на упаковках этого лекарства ).
Другой пример применения полногеномномного секвенирования в фармакогеномике, это использование препарата trastuzumab. Его активная составляющия - моноклональные антитела, которые специфически атакуют исключительно те раковые клетки, которые имеют повышенную экспрессию гена HER2/neu у пациентов, больных раком молочной железы. Поэтому trastuzumab прописывается только тем пациентам, у которых повышена экспрессия гена HER2/neu и на организм которых препарат имеет действие (примерно 10% от общего числа) (Ross et al, 2004). Это один из примеров успешного применения геномных технологий, так как trastuzumab был разработан для относительно небольшой группы HER2/neu-позитивных людей.
Недавно ученые выяснили, почему одни люди относительно легко переносят заражение вирусом гриппа, а другие с последующими осложнениями. Была обнаружена связь между определенной мутацией (rs12252-C) в гене, кодирующем интерферон, индуцирующий трансмембранный белок (IFITM3) и предрасположенностью к осложнениям при гриппе типа H1N1 (Everitt et al, 2012). Мутацию в гене IFITM3можно определить при скрининге генома. Этим людям врачи могут рекомендовать провести вакцинацию в первую очередь. В результате вакцинация становится более целенаправленной и адресной.
Возникновение депрессии частично связано с наследственностью. Было замечено, что некоторые люди избавляются от симптомов депрессии при приеме первого назначенного лекарства. Другим же людям приходится принимать несколько видов лекарств, чтобы определить наиболее эффективное. И все же небольшой части людей не удается избавиться от депрессии с помощью любого из доступных препаратов. Причины этого феномена до конца не ясны. Однако было обнаружено, что носители мутации rs2032583 в гене ABCB1 имеют высокий шанс на успешное лечение такими антидепрессантами, как amitriptyline (Elavil), paroxetine (Paxil), venlafaxine (Effexor) и citalopram (Celexa) (Uhr et al, 2008). Таким образом, этим людям, после соответствующих генетических тестов, может быть назначено адекватное лечение. Метаболизм осуществляется с помощью цитохромов P450 и представляет наиболее распространенный путь метаболизма лекарств. Известно, что существуют быстро- и медленно- метаболизирующие варианты этих ферментов (Phillips, 2001). Учитывая это, компания Roche выпустила тестовую систему AmpliChip CYP450 Test, которая была одобрена американским Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) для мониторинга 29 наиболее распространенных вариантов двух цитохромов P450 (CYP2D6 и CYP2C19). У человека эти ферменты ответственны за метаболизм около 25% лекарственных препаратов. Побочные действия почти 30 препаратов связаны с их увеличением у тех пациентов, которые несут специфические варианты ферментов CYP2D6 и CYP2C19 (Jain, 2005). Некоторые другие вещества, например, тамоксифен, применяемый при лечении некоторых видов рака, превращается в активный метаболит также с помощью системы цитохромов P450. Организм пациентов с низко активной формой CYP2D6 продуцирует меньшую концентрацию активной формы тамоксифена, что приводит к недостаточно эффективной терапии (Dezentje et al, 2009).
Критика использования полногеномного ДНК-секвенирования в клинической практике связана с отсутствием четких указаний для изменения лечения пациентов. Поэтому должна быть проделана большая работа в направлении применения данных полногеномного секвенирования в диагностической и прогностической роли. Однако непосредственной областью применения полногеномного секвенирования для изменения клинических показаний может быть фармакогеномика (Squassina et al, 2010). Арсенал терапевтических средств неуклонно растет на протяжении последних 15 лет. Одновременно с этим появилось более глубокое понимание генов, вовлеченных в метаболизм лекарств. Это особенно важно для понимания биологии рака. Традиционно основным походом к лечению рака для всех пациентов была комбинация химиотерапии, лучевой терапии и хирургии. В настоящее время мы знаем, что различные лекарства метаболизируются с различной скоростью в зависимости от индивидуального генетического полиморфизма человека, что приводит к различной эффективности уничтожения раковых клеток у разных людей. Химиотерапия имеет серьезные побочные действия из-за токсичности применяемых средств, метаболизм которых зависит от индивидуальных генетических различий. Поэтому подбор оптимальной дозы лекарственных средств является важной составляющей качества и успешности лечения пациентов, больных раком.
Заключение
Несмотря на достаточно медленный старт, за последние несколько лет современные технологии полногеномного секвенирования нового поколения и программное обеспечение (для анализирования огромных массивов данных ДНК) позволили достичь значительного прогресса в индивидуальной медицине. Уже накоплено достаточно большое количество примеров, в которых индивидуальная медицина влияет на решения клинических специалистов при выборе способа лечения пациентов. В силу специфических характеристик заболеваний, прогресс индивидуального подхода особенно заметен в онкологии. В других сферах медицины преимущества менее выражены. Однако остаются открытыми вопросы экономической целесообразности (Davis et al, 2009) и некоторых возможностей индивидуальной медицины (Nebert et al, 2008). Так или иначе, полученные результаты и оптимизм исследователей и врачей, позволяет предположить, что индивидуальная медицина имеет большое будущее, которое, вероятно, изменит традиционные преставления о диагностике, подходах к лечению и прогнозированию заболеваний.
Приложение I
Современные коммерческие платформы ДНК-секвенирования
Платформы ДНК-секвенирования 2-го поколения
В последнее десятилетие технологии секвенирования развивались очень быстрыми темпами с одновременным снижением затрат на каждое основание ДНК. Секвенирование, которое десять лет назад стоило 3 млрд. долларов для проекта „Геном человека“, сегодня можно осуществить за десятки тысяч долларов (Drmanac et al, 2010). После успешного секвенирования генома человека были разработаны технологии полногеномного секвенирования, которые имеют свои слабые и сильные стороны (Mardis, 2008) и будут рассмотрены в этом разделе. Основными коммерческими технологиями являются платформы: 454 Sequencing (Roche), Solexa/Illumina (Illumina), SOLiD (Applied Biosystems) и Polonator (Dover). Интенсивная конкуренция между так называемыми "технологиями нового, или второго, поколения" привела к снижению стоимости секвенирования млн. пар оснований ДНК.
В основе ДНК-секвенирования второго поколения лежат следующие два процесса: пространственно-разделенная полимеразная репликация отдельной молекулы ДНК на твердой матрице (микросфере или плоской подложке); циклическое химическое секвенирование. Каждая платформа отличается применяемым методом. Все платформы имеют одинаковые способы приготовления первичной ДНК библиотеки с помощью универсальных адаптеров. Эти олигонуклеотидные адаптеры комплиментарны ПЦР праймерам, используемым для амплификации библиотеки, и олигонуклеотидам, иммобилизованным на твердом носителе для клональной амплификации (Pettersson et al, 2008). Ключевыми особенностями для каждой коммерческой платформы являются последующие шаги.
Фрагменты ДНК лигируются (образование химической связи, с помощью фермента лигазы) с адаптерами и амплифицируются с помощью уникальной для каждой платформы технологии.Такие модифицированные молекулы ДНК амплифицируются на микросферах (454 и SOLiD) или на стеклянной подложке (Illumina). Далее амплифицированные нити ДНК спариваются с комплементарными ДНК нуклеотидами в циклических реакциях в индивидуальных проточных ячейках. В случае комплиментарности последовательности ДНК-матрицы возникает сигнал, который регистрируется системой детекции (Pettersson et al, 2009).
Технологии компаний Roche (454) и Life Technologies (SOLiD 5500 и Ion Torrent) используют эмульсионный ПЦР для синтеза клональных ДНК фрагментов на микросферах (Dressman et al, 2003). Водно-масляная эмульсия, микросферы и исследуемая ДНК смешиваются в прецизионной концентрации так, чтобы каждая микрокапля эмульсии содержала одну сферу и одну молекулу ДНК. После проведения ПЦР реакции, матрицы переносятся в пико-лунки („pico-wells“) или связываются со стеклянной проточной ячейкой (Margulies et al, 2005; McKernan et al, 2009). Illumina использует другую технологию: ДНК-кластеры создаются непосредственно в проточной ячейке с помощью так называемого „мостового ПЦР“ (bridge PCR) на стеклянной подложке (Bentley et al, 2008).
С практической стороны каждый метод обладает своими преимуществами и недостатками. Процесс эмульсионного ПЦР является сложным и трудоемким, хотя каждая из этих компаний разработала автоматизированные технологии, чтобы частично сократить трудозатраты по объему и времени. Генерация кластеров с помощью мостового ПЦР уже полностью автоматизирована. Приборы MiSeq фактически не нуждаются в участии человека в процессах от создания кластеров до анализирования данных, что является очень привлекательным с практической стороны применения. Потенциальным недостатком технологии мостового ПЦР Illumina является то, что успех генерации кластеров не известен до начала самого секвенирования. Это может приводить к дополнительным затратам в случае неудачной генерации кластеров. Но на практике процесс создания кластеров достаточно надежен, если ДНК-библиотеки имеют высокое качество, а концентрации точно выверены с помощью количественного ПЦР.
Каждая из доступных на рынке платформ использует различную «секвенирующую химию» и методы для детекции сигнала. Все платформы 454 типа используют пиросеквенирование, где индивидуальные хемилюминисцентные сигналы означают инкорпорацию основания в цепочку; интенсивность сигнала коррелирует с количеством оснований (Ronaghi et al, 1998). Приборы Ion Torrent используют похожую технологию "секвенирования с помощью синтеза" (sequencing-by-synthesis, SBS), но детектируют сигналы ионов водорода (Н+), которые появляются при работе ДНК полимеразы в процессе инкорпорации нуклеотидов. В сущности, Ion Torrent-чип представляет собой очень чувствительный pH-метер. Каждый чип содержит миллионы ион-чувствительных полупроводниковых транзисторных (ion-sensitive field-effect transistor, ISFET) сенсоров, позволяющих параллельную детекцию множества секвенирующих реакций (Rothberg et al, 2011). Компания Roche заявила, что адаптирует похожую систему детекции через лицензирование технологии DNA Electronics, что сделает 454 и Ion Torrent в принципе идентичными (Roche Partners with DNA Electronics to Help Migrate 454 Platform to Electrochemical Detection, 2010). Достоинствами полупроводниковой технологии являются: сравнительно низкая цена производства приборов, чипов и реагентов; быстрый процесс секвенирования; масштабируемость системы (Robison, 2011).
Технология "секвенирования с помощью синтеза", которая используется в платформах 454 и Ion Torrent, позволяет получать более длинные последовательности ДНК. Возможности платформы Ion Torrent в настоящее время ограничены тем, что размеры фрагментов ДНК намного короче, чем у Roche 454. Однако со временем эта проблема может быть решена. Обе технологии имеют проблему секвенирования гомополимеров, для которых появляются ложные вставки и делеции нуклеотидов. Эта проблема пока не имеет конкретного решения, например, с помощью оптимизации детекции или улучшения программного обеспечения (Meldrum et al, 2011). В платформах Illumina и SOLiD 5500 создаются короткие последовательности ДНК, но применяются различные химические реакции для секвенирования. В аппаратах Illumina используются обратимые терминирующие красители и "секвенирования с помощью синтеза", с применением итерационных циклов включения нуклеотидов, визуализирования и расщепления терминаторов синтеза. В приборах SOLiD применяется "секвенирование лигированием" (sequencing by ligation, SBL), с итерационными циклами лигирования (Sequencing by Oligo Ligation Detection). В процессе "секвенирования лигированием" используется двойное кодирование на каждый динуклеотид, который переводится в цветовой код. В новой технологии „Exact Call Chemistry“, предложенной в инструментах 5500 типа применяется тройное кодирование, обеспечивающее более точное секвенирование. Технологии Illumina SBS имеют преимущество по сравнению с SOLiD SBL в длине сиквенсов, которые составляют до 100 п.н. у HiSeq и 150 п.н. у других инструментов Illumina. SOLiD SBL имеет максимум 75 п.н., но двойное и тройное кодирование обеспечивает более точный процесс (Meldrum et al, 2011).
Первые приборы для секвенирования создавались, в первую очередь, для научных исследований. В результате были созданы такие системы, как 454 GS FLX (Roche), SOLiD (Life Technologies) и HiSeq (Illumina). Эти платформы способны давать на выходе огромное количество последовательностей за один проход. Однако из-за подобного выхода, необходимо примерно 10 дней на один проход для каждого инструмента (SOLiD и HiSeq).
Такие длительные циклы не подходят для сценариев с быстрым оборотом, например, для клинического секвенирования. К тому же, пока стоимость этих приборов слишком высока для исследовательских институтов средней величины. Ответом на эти проблемы стал выпуск компактных „настольных“ („bench-top“) инструментов таких, как 454 FLX Jr (Roche), MiSeq (Illumina) и Ion Torrent (Life technologies). Roche и Illumina пошли по пути уменьшения размеров своих больших приборов, основанных на тех же технологиях ДНК-секвенирования. Система Ion Torrent от Life Technologies базируется на технологии совершенно другого принципа, в которой используется детекция протонов (Н+) на полупроводниковых чипах (Rusk, 2011). Эти приборы имеют важные преимущества: относительно низкую стоимость технологии и быстрое время выполнения секвенирования. Приборы Ion Torrent и MiSeq могут завершить процесс в течение нескольких часов вместо 10 дней, которые требуются для исследований на больших приборов. При низкой стоимости и сокращении времени на выполнение работы возможно проводить ДНК-секвенирование непосредственно на рабочем месте в клинической лаборатории и использовать данные секвенирования в работе с пациентами. Пропускная способность компактных секвенаторов намного ниже, чем у больших инструментов. Однако для целенаправленного клинического секвенирования это не является серьёзным препятствием. Кроме того, компании-производители каждые несколько месяцев увеличивают пропускную способность инструментов, что в дальнейшем снимет вопрос низкой пропускной способности для клинического применения в будущем.
Платформы ДНК-секвенирования 3-го поколения
В настоящее время появились и активно развиваются платформы ДНК-секвенирования "третьего поколения", представленные приборами: Helicos Heliscope (Helicos BioScience Corporation), PacBio RS SMRT (Pacific Biosciences) и MinION (Oxford Nanopore). Третье поколение отличается от второго тем, что первичная амплификация ДНК больше не требуется. Исследуемая ДНК секвенируется непосредственно на уровне одной молекулы с использованием специально созданных полимераз. Преимуществом этого подхода является то, что удается избежать проблем, связанных с накоплением ошибок, возникающих при амплификации ДНК. Однако, важно отметить, что ни одна из технологий третьего поколения пока не получила широкого распространения. Для более подробного ознакомления с технологиями ДНК секвенирования новых поколений рекомендуются следующие обзоры: Mardis, 2008 и Metzker, 2010.
Таким образом, наличие множества платформ и значительное снижение стоимости секвенирования приведут к тому, что технологии нового поколения внесут основной вклад в развитие практической медицины в будущем. Стоимость в размере 1000 долл. За секвенирование одного генома позволит распространить метод полногеномного секвенирования и войти в обычную практику клинической диагностики (Service, 2006). Полногеномное секвенирование, как ожидается, будет основой для новой области медицины – так называемой индивидуальной, или персональной, медицины (термин для personalized medicine еще не устоялся в русскоязычной научной литературе) (Kahvejian et al, 2008; Boguski et al, 2009). Целью индивидуальной медицины станет интеграция клинических симптомов, индивидуальной и семейной истории болезней и последовательности ДНК пациента в медицину нового уровня, которая будет индивидуальна и уникальна (Bryer et al, 2009; Diamandis et al, 2010).
Приложение II
Основные производители систем полногеномного секвенирования: 454 sequencing, Solexa/Illumina, SOLiD, Polonator Helicos Heliscope, Pacific Biosciences SMRT, Oxford Nanopore,
Приложение III
Интернациональные проекты, объединяющие геномные данные: The Cancer Genome Atlas, проект по систематизации информации о раковых геномах, International Cancer Genome Consortium, ICGC, международная научная организация, помогающая координации исследователей по изучению рака, HapMap, глобальный проект по описанию общего паттерна генома человека (Япония, Великобритания, Канада, Китай, Нигерия, США) для создания общественного ресурса, помогающего ученым находить гены, связанные с заболеваниями людей и действием лекарственных средств, Персональная Медицинская Коалиция (Personalized Medicine Coalition), организация, объединяющая участников, вовлеченных в развитие персональной медицины, The National Human Genome Research Institute, организация, осуществившая проект "Геном человека",