Влияние l-карнитина на показатели эякулята у мужчин из бесплодных пар
3 Медицинский центр «Семья» Ключевым патогенетическим звеном развития большинства форм бесплодия у мужчин является окислительный стресс сперматозоидов, однако целесообразность использования антиоксидантных препаратов при этом заболевании не является общепризнанной. Это обусловлено не в последнюю очередь недостаточной изученностью клеточных и биохимических аспектов действия антиоксидантов на мужскую репродуктивную систему. Целью исследования было выявление молекулярных механизмов антиоксидантного действия L-карнитина, трансмембранного переносчика длинноцепочечных жирных кислот, при идиопатической патоспермии. Представлены результаты терапии препаратом Карнитон (1 г/сут) 60 мужчин из бесплодных пар. Влияние L-карнитина на антиоксидантный статус эякулята оценивали методом регистрации хемилюминесценции, а также путем прямого определения общей антиокислительной активности колориметрическим методом по изменению окраски хромогена ABTS. Установлена высокая антиокислительная активность препарата при тестировании в модельных системах in vitro , которая имела отчетливый дозозависимый характер. При исследовании in vivo у пациентов, принимавших L-карнитин, было продемонстрировано статистически значимое увеличение доли прогрессивно-подвижных сперматозоидов категории А, обнаружена позитивная динамика показателей люминолзависимой и Fe 2+ -индуцированной хемилюминесценции эякулята на фоне увеличения антиоксидантной емкости спермоплазмы. Показано, что беременность наступила у 23 % женщин на фоне лечения супруга. Эффект терапии, вероятно, обусловлен нормализацией антиоксидантного статуса эякулята.
Ключевые слова: мужское бесплодие, антиоксиданты, L-карнитин. Введение
L-карнитин является эссенциальной молекулой, вовлеченной в энергетический метаболизм благодаря участию в транспорте ацильных групп через внутреннюю мембрану митохондрий [1]. Карнитин и ацетилкарнитин найдены в высоких концентрациях в эпидидимисе, где они также выступают в качестве антиокислителей, защищая сперматозоиды от действия активных форм кислорода – АФК [2].
Заместительная терапия карнитином активно применяется при мужском бесплодии. В систематическом обзоре клинических исследований эффективности L-карнитина и/или L-ацетилкарнитина, представленном X. Zhou и соавт. [3], продемонстрирована их позитивная роль в коррекции различных форм мужской инфертильности. В целом данные различных авторов не противоречат друг другу, но большинство работ посвящено в первую очередь влиянию карнитина на показатели рутинной спермограммы, и лишь в немногих случаях были исследованы его эффекты на функциональные характеристики сперматозоидов. Так, В.А. Божедомов и соавт. [4] отметили нормализацию акросомальной реакции сперматозоидов на фоне назначения карнитинсодержащих препаратов. Другими авторами была обнаружена корреляция между концентрацией карнитина в сперме и целостностью ядерной ДНК гамет [5], осмотической резистентностью сперматозоидов [6], а также положительное влияние его назначения на уровни восстановленного глутатиона и 8-гидроксидезоксигуанозина в яичках [2].
Вместе с тем молекулярные механизмы антиокислительного действия карнитина остаются неясными [7], что и послужило предпосылкой для выполнения настоящего исследования.
Материал и методы
Обследованы 60 пациентов с идиопатической патоспермией. Возраст мужчин колебался от 23 до 35 лет. Средний возраст пациентов в группе составил 29,2 ± 0,8 года. Все обследованные мужчины состояли в бесплодном браке от 1 года до 10 лет. Пациенты получали L-карнитина тартрат (Карнитон, ЗАО «АКВИОН») по 0,5 г перорально дважды в сутки в течение 3 мес, что соответствует продолжительности цикла сперматогенеза.
Исследование спермы до и после лечения проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1999) по исследованию эякулята и спермоцервикальному взаимодействию [8]: определяли концентрацию, подвижность и долю нормальных форм, методом MAR определяли процент сперматозоидов, покрытых антиспермальными антителами.
Оценку состояния свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности (АОА) эякулята проводили посредством хемилюминесцентного анализа с использованием отечественного хемилюминометра ХЛ-003 [9].
Исследование эякулята начинали через 60 мин от момента сбора материала, после наступления разжижения. Перед измерением свечения исследуемый объем спермы смешивали с 2 мл физиологического раствора, содержащего люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10 -5 М, помещали в светоизолированную камеру прибора и вели запись хемилюминесценции (ХЛ) при 37 °C в течение 5 мин.
Об интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) судили по светосумме и максимальной амплитуде свечения, которые соответствовали скорости образования АФК.
Для регистрации Fe 2+ -индуцированной ХЛ 0,1 мл спермоплазмы добавляли к модельной системе , генерирующей АФК. Конечная концентрация FeSO 4 в среде инкубации составляла 2,5 ммоль. Запись свечения проводили в течение 5 мин при постоянном перемешивании.
При оценке Fe 2+ -индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения, продолжительность латентного периода с момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуду быстрой и медленной вспышки.
Определение суммарной АОА спермоплазмы для оценки мужской фертильности включало в себя оценку Fe 2+ -индуцируемой ХЛ модельной системы, генерирующей АФК; проведение повторной регистрации ХЛ при добавлении спермоплазмы; определение суммарной АОА спермоплазмы по степени подавления свечения модельной системы.
В норме суммарная АОА, определенная при обследовании здоровых фертильных мужчин – доноров спермы, колеблется от 35 до 43 %. При более низких значениях общая АОА является недостаточной [10].
Общую активность антиокислительных систем в эякуляте определяли также колориметрическим методом с помощью стандартного тест-набора Total antioxidant status (Randox Laboratories, Великобритания). Принцип метода основан на подавлении развития окраски хромогена в тестируемой пробе пропорционально концентрации антиоксидантов. Хромоген ABTS R (2,2-азино-ди-[3-этилбензтиазолина сульфонат]) при инкубации с пероксидазой и Н 2 О 2 образует радикал ABTS R + . Полученный раствор имеет стабильный зелено-голубой цвет, интенсивность которого оценивают при 600 нм [11]. Количественное определение ТБК-активных продуктов проводили с использованием набора реактивов «ТБК – Агат («Агат-Мед», Россия). Результаты и обсуждение
На первом этапе были изучены антиоксидантные свойства L-карнитина в модельных системах in vitro . В качестве модели, в которой вызывали образование АФК , использовали фосфатный буфер с добавлением цитрата натрия и люминола. Образование АФК инициировали введением 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа. Реакция сопровождалась ХЛ, избирательно усиливающейся в присутствии люминола.
Полученные данные свидетельствуют о высокой АОА препарата: на рис. 1 видно, что Карнитон в различных дозах значительно подавляет свечение модельной системы, генерирующей АФК.
Рис. 1. Запись ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, при добавлении препарата в различных дозах
1 – контроль, 2 – 0,005 мл Карнитона, 3 – 0,1 мл Карнитона, 4 – 0,3 мл Карнитона (раствор 500 мг/мл). Для того чтобы установить, сохраняются ли антиокислительные эффекты L-карнитина в биологической среде, была дана оценка его влияния на перекисное окисление липидов (ПОЛ). С этой целью препарат добавляли в различных дозах к липидам куриного желтка, сходным по составу с липидами крови [12].
На представленных хемилюминограммах (рис. 2) видно, как уменьшаются показатели медленной вспышки при добавлении в данную модельную систему L-карнитина т. е. антиокислительные свойства препарата сохранялись и в биологической среде.
Рис. 2. Запись ХЛ в модельной системе, инициирующей реакции ПОЛ, при добавлении препарата в различных дозах
1 – контроль, 2 – 0,001 мл Карнитона, 3 – 0,1 мл Карнитона, 4 – 0,3 мл Карнитона (раствор 500 мг/мл). Антиоксидантный эффект препарата был дозозависимым – с повышением концентрации L-карнитина снижалась интенсивность ХЛ (рис. 3).
Рис. 3. Степень угнетения ХЛ модельной системы, инициирующей реакции ПОЛ, в зависимости от дозы Карнитона (раствор 500 мг/мл) Таким образом, в различных модельных системах, в которых индуцировали образование АФК и процессы ПОЛ, Карнитон дозозависимо подавлял ХЛ вплоть до полного угнетения свечения.
На следующем этапе были изучены антиоксидантные свойства Карнитона in vivo . Интегральным критерием состояния мужской репродуктивной функции является анализ эякулята . Результаты исследования спермы представлены в табл. 1.
Таблица 1. Показатели эякулята обследованных мужчин до и после приема Карнитона
Показатель До лечения После лечения Объем эякулята, мл 3,5 ± 0,2 3,6 ± 0,2 рН 7,4 ± 0,1 7,4 ± 0,1 Концентрация сперматозоидов, млн/мл 23,5 ± 2,2 22,5 ± 2,4 Морфологически нормальные формы, % 20,9 ± 0,8 21,8 ± 0,8 Подвижность сперматозоидов, % категории А 19,2 ± 1,7 26,3 ± 2,1* категории B 22,8 ± 1,9 17,4 ± 2,0 категории C 20,8 ± 2,2 19,9 ± 1,7 категории D 36,3 ± 2,0 36,2 ± 2,3 Примечание. * – достоверность различий с показателями у больных до лечения при р<0,05.
При анализе спермограмм патоспермия выявлена у всех 60 пациентов, олигозооспермия – у 33 (55 %), а стенозооспермия – у 37 (62 %), тератозооспермия – у 60 (100 %).
С целью оценки эффективности Карнитона через 3 мес после начала лечения было выполнено контрольное исследование эякулята.
Как показали наши исследования, достоверных изменений стандартных параметров спермограммы на фоне лечения, за исключением содержания прогрессивно-подвижных сперматозоидов категории А, не наблюдалось. Однако суммарная доля сперматозоидов категорий А и В практически не изменялась, что противоречит данным литературы о позитивном влиянии L-карнитина на двигательную активность гамет.
Каких-либо побочных эффектов при приеме Карнитона не выявлено.
Следует подчеркнуть, что результаты MAR-теста у всех обследованных мужчин до и после лечения не превышали нормальных значений.
Наряду с этим, за 3 мес лечения, т. е. за период, в течение которого полностью завершается процесс созревания сперматозоидов, беременность наступила у жен 14 (23 %) пациентов.
Постулируемым, но недостаточно изученным свойством L-карнитина является его АОА. Дисбаланс между продукцией АФК и антиоксидантной способностью различных отделов мужского репродуктивного тракта независимо от этиологического фактора рассматривается как ключевой индикатор окислительного стресса, который хорошо коррелирует со степенью мужской инфертильности [13, 14].
Процессы генерации АФК в сперме изучали у всех мужчин до и после назначения Карнитона по методике, разработанной Д.С. Громенко и соавт. [15].
В качестве основного параметра интенсивности ХЛ рассматривали светосумму свечения за 5 мин измерения. Показатели ЛЗХЛ до и после лечения представлены в табл. 2.
Таблица 2. Уровень ЛЗХЛ (в отн. ед.) семенной жидкости мужчин
до и после приема Карнитона
Показатель ___До_лечения___После_лечения'>Показатель До лечения После лечения Светосумма 3,8 ± 0,53 2,5 ± 0,34* Спонтанная светимость 1,4 ± 0,23 0,9 ± 0,21 Максимальная светимость 1,2 ± 0,19 1,1 ± 0,13 Примечание. * – достоверность различий с показателями у больных до лечения при р<0,05.
Как следует из анализа полученных данных , достоверные различия были выявлены только по величине показателя светосуммы, который на фоне приема препарата снизился более чем в 1,5 раза. Данные различия свидетельствуют о том, что при поступлении L-карнитина наблюдается усиление защитных свойств спермоплазмы в виде повышения уровня суммарной АОА.
Этот параметр является наиболее информативным критерием генерации АФК в сперме. Таким образом, результатами определения состояния прооксидантного звена ПОЛ подтверждается гипотеза о влиянии L-карнитина на способность сперматозоидов продуцировать АФК.
Изучение процессов генерации АФК в сперме у здоровых доноров авторами использованной нами методики позволило разработать нормативные значения показателей ЛЗХЛ эякулята: для светосуммы они составили 2,9 ± 0,8 отн. ед., для спонтанной светимости – 0,9 ± 0,3 отн. ед., для максимальной светимости – 0,7 ± 0,2 отн. ед. [15].
При сравнении данных, полученных у нашего контингента обследованных, с нормативными показателями свечения был выявлен отчетливый тренд к увеличению всех трех параметров до лечения, но эти различия не достигали уровня статистической значимости.
Ранее в исследовании [16] был показан повышенный уровень свободных радикалов в эякуляте бесплодных мужчин.
На следующем этапе работы была дана оценка суммарной АОА эякулята до и после назначения препарата. При оценке Fe 2+ -индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения, продолжительность латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуду быстрой и медленной вспышки. Антиокислительные свойства спермоплазмы выражали в процентах от величины угнетения свечения модельной системы при добавлении к последней 0,1 мл спермоплазмы. До лечения данный показатель составил 38,2 ± 3,7 %, после лечения – 27 ± 2,9 % (р <0,05 по сравнению с контролем).
При сопоставлении данных, полученных при исследовании ЛЗХЛ и Fe 2+ -индуцированной ХЛ, привлекает внимание то обстоятельство, что на фоне терапии L-карнитином уровень светосуммы свечения в исследуемых образцах спермы уменьшался пропорционально степени угнетения свечения модельной системы, генерирующей АФК.
Выявленные методом регистрации ХЛ особенности состояния процессов липопероксидации в сперме инфертильных мужчин нашли подтверждение при определении в тех же образцах общей АОА и концентрации ТБК-реагирующих продуктов (ТБК-РП) (табл. 3). Таблица 3. Содержание ТБК-РП и общей АОА спермоплазмы до и после терапии Карнитоном Показатель Группа обследованных Бесплодные мужчины Фертильные доноры До лечения После лечения ТБК-РП, нМ/мг белка 0,48 ± 0,05 0,32 ± 0,05* 0,33 ± 0,06 Общая АОА, нМ/мл 1,0 0,07 2,33 0,22* 2,54 0,30* Примечание. *– достоверность различий с показателями у больных до лечения при р<0,05. Из представленных в табл. 3 данных видно, что при бесплодии происходит накопление продуктов липопероксидации в семенной жидкости по сравнению с фертильными донорами.
По данным литературы, уровни ТБК-РП в семенной жидкости и в сперматозоидах практически идентичны, в отличие, например, от окиси азота [17]. На основании этого полученные нами результаты можно экстраполировать и на сперматозоиды, в которых также возможна активация свободнорадикальных процессов.
Для нормального функционирования сперматозоидов необходимо соблюдение тонкого равновесия между системами, обеспечивающими продукцию АФК и разрушение АФК. У мужчин при бесплодии наблюдается нарушение этого равновесия, что нашло отражение в повышении образования АФК.
В отличие от концентрации ТБК-РП суммарное содержание антиоксидантов (неферментативное звено защиты) в условиях наблюдения изменялось более существенно – обнаружено более чем 2-кратное увеличение этого показателя после приема L-карнитина. В результате антиоксидантная емкость спермоплазмы на фоне приема препарата фактически не отличалась от показателей фертильных доноров.
Протективное действие Карнитона было сопоставимо с эффектами прямого добавления антиоксидантных ферментов к цельной сперме, сперматозоидам или семенной плазме, как было показано в работах ряда авторов [18, 19], что позволяет рекомендовать использование Карнитона в комплексной терапии идиопатического мужского бесплодия. Заключение
Очевидно, что нормализация антиоксидантных характеристик семенной жидкости является обязательной предпосылкой восстановления оплодотворяющей способности эякулята. Несмотря на прочную связь оксидативных повреждений с низким качеством спермы, мужчины очень редко проходят проверку на окислительный стресс или получают лечение от него, т. е. сам факт его существования игнорируется большинством специалистов по лечению бесплодия.