Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему: Состояние регенераторных процессов тканей в условиях воздействия на организм экстремальных факторов
Автореферат диссертации по медицине на тему Состояние регенераторных процессов тканей в условиях воздействия на организм экстремальных факторов
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ (РОССИЯ) ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЦДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ
На правах рукописи
. ЦВИРЕНКО Сергей Васильевич
Состояние регенераторных процессов тканей в условиях воздействия на организм экстремальных факторов
14.00.16 - Патологическая физиология
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Уральского государственного ордена Трудового Красного знамени медицинского ' .института
доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, академик АЕН РФ А.П .Ястребов
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, про(|)ессор, член-корр. РАН В.А.Черешнев .доктор медицинских наук, профессор, член-корр. АН Башкортостана
доктор биологических наук, профессор Т.ВАпферова
Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт общей патологии и патологической физиологии АМН РФ
Защита диссертации состоится"_"_1994 г. ч
в_час на заседании Специализированного совета Д - 084.04.01 при
Челябинском государственном медицинском институте по адресу: 454092, г.Чеяябинск, ул.Воровского, 64.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского государственного медицинского института
Автореферат разослан _"_, 199 г.
Ученый секретарь Специализированного ученого совета,
доктор медицинских наук Л.В.Кривохижина
Актуальность проблемы. Изучение механизмов повреждения и адаптации при действии на организм экстремальных факторов является одной из важнейших медико-биологических проблем, тесно сопряженной с пониманием развития самой разнообразной патологии, с углублением представлений об общих закономерностях поддержания и восстановления гомеостаза в организме, разработкой эффективных способов профилактики и лечения различных повреждений и заболеваний.
Значительную роль в развитии компенсаторно-приспособительных реакций при экстремальных воздействиях играют регенераторные процессы [Крыжановский, 1974; Ястребов и др., 1988], поскольку они не только обес-печк. цют восстановление дефекта ткани при ее повреждении, но и являются структурной основой усиления той или иной функции ткани и клетки [Саркисов 1977, 1987]. Современные теоретические представления дают основание полагать, что интенсивность, характер и резервные возможности регенераторных процессов существенно влияют на резистентность организма к экстремальным факторам, действие которых сопровождается функциональными и структурными изменениями, а при продолжительном воздействии тесно связаны с формированием адаптации организма в новых условиях. С другой стороны, экстремальные факторы вызывают значительные сдвиги во внутренней среде организма и, таким образом, могут трансформировать регенераторные процессы, т.е. структурную основу компенсации и адглтации.
Исследованию состояния регенераторных процессов при действии на организм различных экстремальных факторов посвящен целый ряд работ [Кириллов, 1977; Тимошин, 1983; Барбараш, Двуреченская, 1986; Карлыев, 1586; Вдовенко, 1987; Кодолова 1987; Мельник, 1987; Сазонов, 1990; Негоих, 1970; Но1ескоуа, Ваийугоуа, 1975; ОКахи Ы а. 1984; и др.]. Однако,приведенные данные о величине и направленности измеьеннй зачастую противоречивы и не дают полного представления о закономерностях реагирования этих процессов в новых условиях. Ограничены сведения о механизмах наблюдаемых перестроек. Из многочисленных регуляторных факторов основное внимание в литературе уделено гормонам [Кириллов, 1977: Тимошин, 1983; Мельник, Тимошин, 1984; Меерсон, 1986; Шкурупнй, 1988; Б^еюЬЬап, 1986]. В последние годы получены данные, свидетельствующие о важной роли я условиях экстремальных воздействий других механизмов, в том числе различных метаболитов [Ужиискчй, 1968; Ястребов и соавт., 1978; Макеев, 1981; Гольберг и соавт.,1983;
Юшков, 1984; Ястребов, 1984; Ястребов и соавт., 1988; Северин и соавт., 1989]. Необходимость дальнейших исследований в этом направлении связана с поисками эффе:сгивных средств целенаправленного влияния на пластические процессы с цепью коррекции их нарушений.
В этом отношении первоочередного внимания заслуживает состояние метаболических процессов в ткани н,в частности .энергетического и лизосомалыю-го аппаратов, системы перекисного окисления липидов и антиокислительной активности (ПОЛ-АОА), которые,с одной стороны,вовлечены в превращение покоящихся клеток в пролиферирующие и активно синтезирующие [Месрсон, 1967; Бреслер и соавт., 1969; Исанин, Яковлев, 1977; Бурлакова, Пальмина, 1982; Волков, Мустафин, 1982; Епифанова и соавт. 1983;], а с другой стороны, закономерно трансформируются при экстремальных воздействиях [Владимиров, Арчаков, 1972; Бурлакова и соавт., 1975; Покровский, Тутельян, 1976; Кондрашова и соавт., 1977; Панин, 1978; 1983]. Не исключено, что перечисленные процессы нр только тесно сопряжены с отдельными биосинтетическими реакциями и событиями клеточного цикла, но в условиях действия на организм экстремальных факторов могут выступать в роли индукторов адаптивного роста ткани. Следствием изменения внутриклеточного метаболизма может быть изменение микроокружения клеток, в частности гликозами-ногликанов (ГАГ), которое играет важную роль в пролиферации и функционировании клеток [Епифанова и соавт., 1983; Ястребов и соавт., 1988].
Уникальный материал, вскрывающий и детализирующий значение и механизмы регенераторных и метаболических перестроек в процессе адаптации к экстремальным факторам, может дать исследование животных из природных' популяций, обитающих в различных климато-географических регионах и обладающих эволюционно складывающимися наиболее оптимальными свойствами и реакциями, а также их реагирования на действие экстремальных факторов.
Предпринятое в настоящей диссертационной работе изучение регенераторных и некоторых обменных процессов в тканях послужило основанием для разработки концепции о том, что состояние метаболизма в клетке (ткани) играет роль конечного этапа формирования'интенсивности, а,возможно, и характера регенераторных процессов.
Цель работы. Исхода из вышеизложенного,состояла в выяснении ¡13-менепий интенсивности и характера регенераторных процессов в тканях при воздействии на организм -ж-гремалы:ых факторов, ахаю« ведущих механизмов влияния экстремальных факторов из процессы регенерации.
1). Охарактеризовать состояние процессов адаптивного роста (неиндуциро-ванной и индуцированной регенерации) в тканях различного типа - печени и костного мозга в динамике экстремальных воздействий на организм (холода и условий высокогорья).
2). Определить особенности состояния регенераторных процессов у животных из природных популяций, обитающих в различных климато-гео графических зонах.и их реакции на холодовое воздействие.
3). Изучить состояние энергетического метаболизма, лизосомального аппарата, перекисного окисления липидов, динамику содержания гликозаминогли-канов в тканях при экстремальных воздействиях на организм и определить "а'-'ь метаболических процессов в изменении регенерации в этих условиях.
4;. Определить особенности метаболических процессов у животных природных популяций и их изменение при холодовом воздействии.
5). Выяснить характер взаимодействия указанных метаболических факторов в регуляции регенерации тканей.
Научная новизна и теоретическая значимость. В работе с помощью современных методов, в том числе разработанных и модифицированных автором, получены новые оригинальные данные, касающиеся изменения (активации) регенераторных процессов в печени при действии на организм холода и условий высокогорья и особенностей регенераторного ответа на повреждение ткани (резекцию органа) при действии холода различной длительности. Детально исследовано костномозговое кроветворение в динамике холодового воздействия на организм, а также особенности реагирования кроветворной ткани на регенераторный стимул в этих условиях. Впервые охарактеризованы состояние энергетического метаболизма, активность лизосомального аппарата и перекисного окисления липидов в костном мозге в динамике холодового воздействия. Получены новые оригинальные данные о состоянии этих процессов при охлаждении в печени. Подтверждена роль глико-
заминогликанов как регуляторов регенераторных процессов при экстремальных воздействиях как в кроветворной ткани, так и в печени. Получены новые оригинальные данные о ДинамИке некоторых важнейших метаболических процессов в печени и костном мозге при индукции регенерации как в обычных условиях, так и при действии на организм экстремальных факторов. Показана возможность влиять на активность регенерации путем направленных воздействий на метаболичесхие процессы в ткани. Впервые обнаружено, что введение хлороквина, изменяющего уровень лизосомальных процессов, ускоряет восстановление эритрона после кровопотери. Установлены механизмы взаимосвязи некоторых метаболических факторов в тканях при экстремальных воздействиях на организм. Впервые получены данные о роли митохондрий в поддержании антиокислительной акта [угости в ткани. Обнаружены особенности регенераторных процессов в печени и костном мозге, а также некоторых метаболических процессов в печени у животных, обитающих на Севере, их реакций на холод и на гипоксию, что позволило выделить механизмы оптимальной адаптации организма к экстремальным условиям Севера. Разработана новая концепция о роли состояния метаболических процессов в ткани в детерминировании интенсивности и характера регенерации.
Практическая ценность и пути рея л и з а ц и и . Полученные данные расширяют представления об общих механизмах повреждения и компенсации в тканях при действии на организм экстремальных факторов. Результаты работы доказывают необходимость и возможность коррекции регенераторных процессов в тканях при их повреждении в условиях действия на организм экстремальных факторов. Проведенные исследования, дают теоретическое обоснование возможностей направленного влияния на регенерацию в тканях через метаболические факторы с учетом силы и времени воздействия на последние.
Установленные в работе особенности регенерации и метаболизма у животных из природных популяций, обитающих на Крайнем Севере, дают основание для выделения критериев оптимальных адаптивных перестроек при действии на организм экстремальных факторов как в эксперименте, гак и в условиях клиники.
На пути к достижению цели настоящей работы предложен и апробирован новый способ подготовки препаратов для радиоавтографического исследова-
ния печени, разработан способ определения свободнорадикального окисления в биопрепаратах (авторское свидетельство № 1702319).
Результаты работы послужили основанием для обследования состояния окислительного метаболизма и гемопоэза у металлургов Заполярья, данные которого использованы при разработке "Санитарных правил для предприятий медно-никелевой промышленности".
Внедрение результатов исследований. Результаты исследований используются в лекционном курсе и практикуме по патологической физиологии, гистологии и биохимии на кафедрах Уральского медицинского института при преподавании разделов:
патофизиология экстремальных состояний, патофизиология системы крови, патофизиология печени, регенерация органов и тканей, тканевое дыхание, сво-боднорадикальнос окисление.
Способ подготовки препаратов для радиоавтографического исследования печени внедрен в морфологическом отделе ЦНИЛ, кафедре гистологии, кафедре биологин Уральского медицинского института, и патофизиологическом отделе Института фармакологии Томского научного центра РАМН, в Уральском НИИ травматологии и ортопедии.
Способ определения свободнорадикального окисления внедрен в Областной детской клинической больнице N 1, в Свердловском областном психо-невро-логическом госпитале для инвалидов войн.
Комплексный эколого-физиологический подход в изучении регенераторных и метаболических процессов в тканях при воздействии на организм холода внедрен в научно-исследовательскую практику "Лаборатории экологических основ изменчивости" Института экологии растений и животных" УрО РАН.
Апробация работы. Результаты работы были доложены и представлены на 111 Всесоюзном съезде патофизиологов (Тбилиси, 1983), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), V съезде Всесоюзного Тнреологического Общества АН СССР (Москва, 1990). Учредительном конгрессе Мезкдународного общества по патофизиологии (Москва, 1991), на Всесоюзных конференциях: "Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции" (Пущино, 1981), "Теоретические и клинические аспекты патофизиологии дыхания" (Куйбышев,
1983), "Метаболическая регуляция физиологического состояния" (Пущино,
1984), "Энергетические аспекты клеточной физиологии "(Пущино 1988), "Ускорение социально-экономического развития Урала" (Свердловск, 1989), "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды" (Новосибирск, 1990), "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратное обеспечение" (Москва, 1992); II съезде физиологов Уральского региона (Свердловск, 1990), XI, ХП, Х!П, XIV научных конференциях патофизиологов Урала (Уфа, 1982, Пермь, 1986, Ижевск, 1989, Челябинск, 1991), на II и III конференциях биохимиков Урала и Западной Сибири (Томск, 1980, Тюмень, 1982), на I, II, IV Областных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов (Свердловск, 1986, 1988, 1990), на годичных научных сессиях УрГМИ (Свердловск, 1987, 1989, 1990). По материалам диссертации сделаны сообщения на заседаниях научных обществ патофизиологов и биохимиков.
Публикации По теме диссертации опубликовано 26 работ.
На защиту выносятся следующие положения:
Действие экстремальных факторов на организм сопровождается активацией и перестройкой процессов неиндуцированной (физиологической) регенерации и формированием нового морфо-функционального состояния ткани. Регенераторный ответ тканей на повреждение в условиях действия экстремальных факторов нарушается.
Изменение регенераторных процессов в тканях при воздействии экстремальных факторов тесно связано с состоянием метаболизма, в частности окислительных энергетических процессов, перекисного окисления липидов и анти-окнслнтельной активности, активности лизосомальных ферментов, содержания глнкозаминогликанои.
Устойчивая адаптация животных к экстремальным факторам условий обитания на Крайнем Севере характеризуется формиронанием выраженных особенностей регенераторных и метаболических процессов в тканях.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 435 страницах машинописного текста, содержит 90 таблиц и 25 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, трех глав собственных исследований, общего заключения, выводов п списка литературы, включающег о 398 рабо т на русском и 180 работ на иностранных языках.
Материал и методы исследования. Эксперименты проведены на крысах линии Вистар и на белых беспородных крысах массой 150-250 г (всего 1196); мышах-самцах СБА массой 19-22 г (38 животных); красных полевках (Clethrionomvs ruii'us Pall) массой 18-22 г , отловленных из природных популяций, обитающих в Курганской области (25 животных) и на полуострове Я мал (31 животное); сибирских леммингах (Lemmus sibiricus Kerr) массой 40-50 г (! 3 животных), отловленных на полуострове Ямал.
Холодовое воздействие на животных осуществляли в термокамере "VT-1000" (ГДР) по 23 <4 в сутки при температуре 0°С. Ректальную температуру контролировали с помощью электротермометра ТПЭМ-1. Общее потребление кислорода животными измеряли с помощью газоанализатора МН-51-30. Действие условий высокогорья исследовалось на высоте 3200 м над уровнем моря (высокогорная база 1ДНИЛ Киргизского мединститута).
Состояние регенераторных процессов в печени и костном мозге изучали на моделях неиндуцированной (физиологической) и индуцированной (репара-пшмой) регенерации. Последнюю вызывали удалением 2/3 массы печени -частичной гепатэктомии гю Hij-gins, Anderson (ЧГЭ); путем выполнения кровопускания (острой кровопотерей) из яремной вены в количестве 2% от массы животного; введением интри га кобальта (25 мкмоль на 100 г массы).
Для оценки регенераторных процессов в костном мозге определяли содержание в крови эритроцитов, ретикулоцитов, гемоглобина, лейкоцитов, кле-то'шость костного мозга, миелограмму. Высчитывали соотношение лей-ко/эритро. индексы созревания эритробластов и нейтрофилов, количество клеток, способных к проли([>срацш1. ДН К-синтезирующую способность миелока-риоцитов определяли радооавтографическим методом с использованием ^Н-тамндина (Епифанова и др. 1977). Препарат ( 5-метил-3Н-тимндин удельная актиичость 890 Тбк/моль) вводили животным внутрибрюшинно в дозе 1 мкюори (37 Кбк) на I г массы за 1.5 ч до забоя. Интенсивность синтеза ДНК оценивали по включению Зн-тимидина в ДНК миелокариоцитов, измеряемому с помощью жидкостной сцинтилляционной радиометрии на счетчике СЕС-2.
Для оценки регенера горных процессов в печени на гисюлошческих препаратах определяли митотический индекс, индекс альтерации, количество дву-
ядерных клеток с использованием окулярной измерительной сетки (Автанди-лов, 1990). В ядрах изолированных гепатоцитов цитофлуориметрическим методом (Карнаухов, 1978, Козинец и др., 1986) на комплексе ЛЮМАМ И-3 (ЛОМО) измеряли количество ДНК (Хачатуров и др., 1966) с последующим распределением клеток по плондности и фазам клеточного цикла (Dean, 1980). С помощью радиоавтографического метода с ^Н-тимидином определяли количество гепатоцитов в S-фазе. В печени пг.;<_-рялн содержание нуклеиновых кислот после их разделения no Schmidt, Thannhauser спектрофотоме-фическим методом (Цанев, Марков, 1960). Определяли интенсивность включения 3Н-ти-мидина в ДНК. Регистрировали абсолютную и относительную массы органа, а также процентное содержание в ткани сухого вещества.
О характере и интенсивности окислительных энергетических процессов в тканях судили по показателям дыхания гомогената и выделенных митохондрий печени и клеток костного мозга. Скорость потребления кислорода препаратами измеряли полярографическим методом в ячейке с закрытым платиновым электродом типа Кларка (Коваленко и др., 1975). Использовались различные функциональные пробы и ингибиторы участков дыхательной цепи (Ленинджер, 1966, Кондрашова, 1973,1975, Кондрашова и др., 1977, Лукьянова и др., 1982). Оценивали дыхание на эндогенных субстратах (V энд), в присутствии 4 мМ сукцината (V як), на сукцинате в присутствии АДФ (Уз), в отрегулированном во стоянии (V 4), на НАД-зависимых субстратах( 7 мМ ß-оксибути-рата шш 7 мМ глутамата), в ггрисутствии разобщителя дыхания и фосфорили-рования - 100 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ). Проводили ингибиторный анализ дыхания препаратов на эндогенных субстратах в присутствии разобщителя с помощью малоната (2 мМ) и амитала (1 мМ) с последующим вычислением доли и абсолютной величины малокатчувствительного, амиталчувствительно-го и амнталмалонатрезистентного дыхания. Скорость дыхания выражали в наноатомах кислорода в мин на мг белка или на 10^ миелокариоцитов.
Для оценки состояния процессов перекисного окисления липидов и антиокислительной активности определяли содержание в ткани- диеновых конью-гатов высших ненасыщенных жирных кислот (Стальная, . 1977), ТБК-активных продуктов.(Стальная, Гаришвили 1977) и показатели Ре-+-индуцированной (в гомогенате печени) и Н2О2 -индуцированной (в суспензии миелокариоцитов) хемилюминесценции, отражающей соотношение про- и антиоксидантов в исследуемой пробе (Владимиров и др., 1974, Лопухин и др., 1983, Серкиз и др.,
1984, в нашей модификации). Рассчитывали следующие показатели: h - амплитуда быстрой вспышки после добавления Fe^+, 1 - латентный период, tga -нарастание свечения в ходе медленной вспышки, h' - амплитуда быстрой вспышки при повторном добавлении Fe2+, светосумму Н2О2 -индуцированной вспышки и коэффициент спада хемшпоминесценции. Все показатели выражали в относительных единицах.
Функциональное состояние лнзосомального аппарата оценивали по уровню активности маркерных ферментов - кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2) и ДНК-азы (КФ 3.4.6) в гомогенате тканей (de Duve 1959, Дингл, 1980). Определяли свободную и общую (после разрушения лизосомных мембран тритоном Х-100) активность ферментов, соотношение которых характеризует стабильность мембраны лизосом.
В печени и костном мозге определяли содержание уроновых кцслот (кислые гликозаминогликаны - кГАГ) методом Bitter, Muir (1962) и нейтральных гли-козаминогликанов (нГАГ) методом Warren (1959).
Белок в препара тах определяли по Lowry et а!.(1951) или с биуретовым реактивом (Бейлн, 1965).
При изучении влияния метаболических факторов на регенераторные процессы изменение функционального состояния лизосом достигалось введением животным хлороквина ("Алколоида" Венгрия) внутрибрюшинно в дозе 0.25 и 1.0 мг на кг массы животного за 2 ч до инъекции нитрита кобальта или операции кровопускания. Повышение фонда антиоксидантов в организме создавалось инъекциями ионола внутрибрюшинно за супсн до ЧГЭ в дозе 100 мг на кг массы. Стимуляцию ПОЛ вызывали инъекциями Ре2+-аскорбатной смеси в течение 4 суток, ежедневно вводили по 14 мг FeCl2 u 85 мг аскорбиновой кислоты на кг массы. Для стимуляции энергетического метаболизма животным подкожно вводилась смесь сукцината и глутамата по 100 и 50 мг на кг массы соответственно (рН=7.3-7.4), или только сукцинат в такой же дозе.
Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощь ¡о параметрических методов на ПЭВМ "Электроника ДЗ-28" (Бейли, 1962, Шаффе, 1980, Дьяконов, 1987).
Результаты исследования и обсуждение полученных данных
1. Состояние регенераторных процессов в тканях при экстремальных воздействиях.
Для установления общих и частных закономерностей исследовали ткани двух типов: растущая - печень, обновляющаяся - КМ, различающиеся по способу и интенсивности регенерации (Балаж, Блажек, 1982, Бабаева. Зотиков, 1987). Для решения поставленных вопросов мы считали целесообразным исследовать как физиологическую (неиндуцированную), так и репаративную (индуцированную) регенерацию.
На основании проведенных исследовании установлено, что непрерывное воздействие холода на организм сопровождается изменениями процессов физиологической и репаративной регенерации в тканях, проявляющимися как количественными, так и качественными особенностями, зависящими от продолжительности действия эксфемального фактора и типа ткани.
В печени под влиянием холода активируется пролиферация гепатоцитов (табл. 1). Включение ^Н-тимидина в ДНК увеличивается через 3 суток на 20.7% (р>0.05), через 14 суток на 123.3% (р<0.05). Количество клеток промежуточных классов плоидности 2С-4С, 4С-8С -"синтезирующие" возрастает через 3 суток на 175.СС'. 7 суток - 437.5%, 14 суток - 93.8"/» (р<0.05). Вместе с тем процессы внутриклеточной регенерации несколько угнетаются в ранний период действия холода и активируются к 14 суткам, что проявляется развитием клеточной гипертрофии. В ранние сроки охлаждения (3 суток) наблюдается снижение плоидности гепатоцитов (-14.4%) и количества двуядерных клеток (-47.9% р<0.05). В последующем эти показатели постепенно возрастают, но не достигают исходного уровня. Наблюдаемая сгимуляция процессов адаптивного роста сопровождается увеличением абсолютной и относительной массы печени (в пределах 10% р<0.05), что согласуется с данными других авторов (Слоним, 1970, Майстрах, 1976, Негоих, 1958, Smith, Hoijer, 1962, Holeckova, Baudysova, 1975). Аналогичные сдвиги обнаружены нами в печени в условиях высокогорья, что свидетельствует о неспецифичном характере этих изменений по отношению к природе экстремального воздействия.
Адаптивный рост в печени при действии экстремальных факторов обес-печиваегся за счет процессов, характерных для ткани и в обычных условиях,
однако активность и соотношение их меняется во времени, что и создает свое-' образце структурно-функционального состояния ткани в динамике процесса адаптации, которое, по-видимому, зависит от силы и продолжительности воздействие.
Динамика некоторых показателей регенераторных процессов в
печени и костном мозге при холодовом воздействии. ' М ±т
Показатель Контроль 3 7 14
Вкг.юч. Зц-тимидина !50.9±21.7 182.2±19.0 - 336.9+31.2*
5к/мг ДНК гвчвии
ДНК печени, мг/г 8.7+1.8 10.4+1.5 - 5.8±0.6
Средняя плоидиость 8.982 7.690 6.772 8.178
"Синтезирующие" 1.6 4.4* 8.6* 3.1 *
Эритроидные клетки 31,0±2.1 43.2±4.6* 34.8±3.9 38.3±3.1
Эритрокариоциты. 8.3±0.8 16.7±1.7* 10.3±1.6 7.9±1.0
Эритрокариоциты,си- 3.5Ю.6 8.0+0.5* 5.9+0.6* 2.6+0.5
нтезир. ДНК, 10б/6
Включ. ^Н-тимидина 6.1+0.3 7.2±0.9 8.2+0.6* 8.4±0.9*
б Бк/10 миелокарио-
Примечание: * - р<0.05 при сравнении с контролем.
В кроветворной ткани при действии низкой температуры на организм экспериментальных животных увеличивается продукция эритроцитов. При этом в ткани сначала (3 суток воздействия) наблюдается увеличение количества эрит-роидных клеток (+39.6% р<0.05) и их доли среди всех миелокариоцитов (+44.1%) при сокращении гранулоцитарного ростка и мало меняющемся лим-фоидном, возрастание количества эритроидных клеток, способ ныхк пролиферации (+100.0% р<0.05) и "синтезирующих" эритрокариоцитов (+125.4% р<0.05), но без значительного прироста включения ^Н-тимидина в Б-клетки, т.е. скорости течения пролиферативных процессов в клетке (табл. 1). Позднее, через 7 и особенно 14 суток скорость синтеза ДНК постепенно повышаете? (соответственно +34.4% и +37.7% р<0.05), что, по-видимому, отражает ускорение фаз клеточного цикла и сокращается время генерации зрелых клеток. Такая последовательность мобилизации резервов кроветворной ткани носит неспецифический характер и наблюдается при постоянно сохраняющемся, или усиливающемся стимуле других патогенных факторов (Акоев, Мотлох, 1984). Вместе с тем особенностью состояния регенераторных процессов в КМ при продолжительном холодовом воздействии является сокращение пула клеток, способных к пролиферации в эритроидном ряду (через 14 суток их абсолютное число падает на 5.52%, а доля - на 23.7%) без снижения продукции зрелых клеток. Регенераторная реакция в КМ в ответ на холодовое воздействие хорошо согласуется с результатами клинических наблюдений за гематологическими показателями у людей, проживающих на Крайнем Севере (Дегтева, 1982, 1983, Марачев, Корнев, 1983, Авцынидр., 1985, Баркова, 1985).
Продолжительное экстремальное воздействие сопровождается и в печени, и в КМ формированием нового соотношения процессов, обеспечивающих адаптивный рост в ткани. Так,в печени под действием холода снижается количество полиплоидных клеток, в том числе двуядерных, а, следовательно, и средняя плоидность гепатоцитов. В КМ при продолжительном холодовом воздействии сокращается пул клеток, способных к пролиферации в эритроидном ряду без снижения продукции зрелых клеток.
Исследование влияния холода на репаративную регенерацию в тканях выявило зависимость ее интенсивности и характера от продолжительности действия экстремального фактора. Так, в печени при непродолжительной экспозиции (охлаждение только в послеоперационном периоде или 3 суток до операции и в послеоперационном периоде) нарушается индукция покоящихся клеток
и процессы предмитотической подготовки, о чем свидетельствует снижение ИМЯ , смещение пика включения ^Н-тимидина в ДНК на более поздние сроки, уменьшение МИ (рис. 1, 2) Кроме того изменяется динамика
Рнс. 1 Изменения а регенерирующей печени при холодовом воздействии в послеоперационном периоде (% от контроля)
1 - МИ; 3 - макочеяие Зн-тимидина; 2 - ИМЯ; 4 - ДНК; 5 - 2-адерные; б - плсядность
количества дзуядериых и полиплоидных гепатоцитоз, показателя средней плоиднссти, содержание ДНК в ткани. При более продода^телыюм действии низкой температуры (14 суток до ЧГЭ и в течение послеоперацио!шого периода) наблюдается рассинхронизация пролиферативного ответа при которой часть клеток ускоренно вступает и проходит фазы митотичесхого цикла, что проявляется более ранним повышением включения ^Н-тимидаша в ДНК (12 ч ), а также МИ (24 ч), вместе со снижением этих показателей в
Вргия по ЧГЭ,час
Рнс.2 Изменения в регенерирующей печени при холодовом воздействии в течение 3 суток послеоперационном периоде (% от контроля)
1 - включение 3Н-тнмидина; 2 - ИМЯ; 3 - МИ; 4 - плоидностъ; 5-ДНК; 6-2-ядерные;
последующие сроки регенерации. У животных этой группы меньше средняя плоидностъ гепатоцитов, больше количество диплоидных клеток, но выше содержание ДНК на г сухого веса ткани (рис. 3). Таким образом, под влиянием экстремального фактора изменяется соотношение обычных компонентов регенераторного ответа, в частности тормозится развитие гипертрофии и полиплоидии, что, впрочем, может носить адаптивный характер.
В КМ репаративная регенерация после кровопотери более резистентна при действии на организм низкой температуры. Охлаждение только после операции не сказывается на реакции гемопоэтической ткани, а воздействие в течение 3 суток до операции и в постгеморрагическом периоде даже ускоряет восстановительные процессы. Последнее проявляется более высоким уровнем гемоглобина и периферической крови (через 1 сутки после кровопотери +17.6%,
через 3 суток ■ +16.1%, через 7 суток - +14.6% р<0.05), более ранним
Рис.3 Изменение показателен регенерирующей печени при холодовом
воздействии в течение 14 суток до ЧЮ и в послеопсрациоипом периоде (% от контроля).
1- ИМЯ ; 2 - плоидность;; 3 - МИ; 4 - включение ^Н-тимидииа; 5 - ДНК; 6 - 2-ядсрные;
развитием ретикулоцитарной реакции (через 3 суток - +27.2% р<0.05), увеличением количества миелокарноцнтов, включающих Зн-тимидин (через 1 сутки - +12.0%, через 3 суток - +24.8% р>0.05), в том числе среди клеток способных к пролиферации в эритроидном ряду (через 1 сутки - +19.2%, через 3 суток -+51.9% р<0.05). При длительной холодовой экспозиции наряду с заметным снижением абсолютного количества эритрокариоцитов (через 1 сутки после кровопотери - 6.6% р>0.05, через 3 суток - -29.6% р<0.05, через 5 суток - - 27.4% р<0.05) и преходящем угнетении вступления клеток в пролиферацшо (через 5 суток -30.2% р<0.05) наблюдается увеличение включения ^н-тимидина в клетки, находящиеся в Б-фазе (через 3 суток - +57.9%, через 5 суток - +108.0% р<0.05). В целом восстановление эритрона у животных этой группы
задерживается. Аналогичное удлинение восстановительного кровопотери отмечается у жителей Заполярья (Баркова, 1985).
2. Состояние метаболизма в тканях и его роль в изменениях регенераторных процессов при экстремальных воздействиях.
Важную роль в изменении регенераторных процессов в тканях при экстремальных воздействиях играют метаболические факторы. Об этом свидетельствует анализ динамики обменных процессов в тканях в этих условиях.
В печени наиболее выраженные сдвиги отмечаются в ранний период действия низкой температуры (3 суток). Скорость потребления кислорода гомогена-том в различных метаболических состояниях на эндогенных и добавленных субстратах увеличивается на 15-40% . При этом неизменными остаются показатели энергетической регуляции (дыхательный контроль) и сопряжения окисления и фосфорилированмя (АДФ/О). Активность малонатчувствительного и амиталчувствительного дькания при использовании эндогенных субстратов возрастает на 140.5% и 184.6% соответственно (р<0.05). Результаты свидетельствуют об усилении энергетического метаболизма с повышением активности окислительных ферментативных систем и возрастанием содежания эндогенных субстратов. Через 7 и 14 суток сохраняются отдельные признаки активации энергетического аппарата, но отклонение показателей от контроля незначительно. В ранний период действия холода в печени повышается ПОЛ, понижается АОА и уменьшается окисляемость липидов, о чем свидетельствует увеличение содержания диеновых коньюгатов (+17.6% р<0.05) иизменение показателей Ре^+- индуцированной хемилюминесценции (достоверный рост Н и снижение Ь). В последующем АОА и окисляемость липидов постепенно повышается. Через 3 суток охлаждения в печени несколько возрастает процент свободной активности КФ (+16.4% р>0.05), что отражает тенденцию лабилизации лизосомальных мембран. Позднее признаки этого не отмечаются. Через 8 и 14 суток отчетливо увеличивается общая активность ДНК-азы (+27.9% и +53.2% р<0.05). Под влиянием холода содержание кГАГ в печени через 3 суток снижается более чем наполовину, а в последующем постепенно возрастает, но к 14 суткам не достигает исходных значений. Содержание нГАГ, напротив, через 3 суток увеличивается на 51.2% (р<0.05), а в последующем не отличается существенно от контроля.
Дыхание миелокариоцитов в различных метаболических состояниях мало отличается от исходных показателей через 3 суток, но по мере увеличения продолжительности охлаждения животных оно прогрессивно повышается. Однако, через 7 суток снижается количество эндогенных субстратов, особенно НАД-зависимых, что отражает уменьшение величины амиталчувствительного дыхания клеток в присутствии разобщителя (-28.3% р<0.05). Через 14 суток общий фонд эндогенных субстратов в миелокариоцитах восстанавливается, примерно на 50% увеличивается долевой вклад в окислительный метаболизм сукцината и липидов. Интенсивность ПОЛ в клетках костного мозга повышена, особенно через 3 суток, а АОА имеет тенденцию роста в динамике холодо-вого воздействия, о чем свидетельствуют изменения содержания диеновых коньюгатов и показателей Н2О2 -индуцированной хемилюминесценции. В миелокариоцитах отмечается лабилизация лизосомальных мембран (через 3 суток +41.5% р>0.05, через 8 суток +226.3% р<0.05, через 14 суток +102.7% р<0.05) и признаки активации лизосомального аппарата. Содержание кГАГ в костном мозге снижается через 7 суток воздействия на 27.4% (р<0.05), через 14 суток - на 57.0% (р<0.05), а нГАГ, напротив, возрастает соответственно на 224.2% и 113.3% (р<0.05).
Установлено, что динамика сдвигов метаболических факторов в печени и костном мозге под влиянием холода заметно различается, однако, имеются и общие закономерности. В обеих тканях развивается преходящая активация лизосомального аппарата и ПОЛ с постепенным нарастанием АОА, интенсифицируется окислительный метаболизм, наблюдается снижение кГАГ и повышение нГАГ. Последнее специфично для холодового воздействия на организм.
Подтверждают существование тесной связи изменений метаболизма в ткани и регенераторных процессов результаты исследования показателей обмена в ключевые моменты развития реакции на резекцию печени или кровопускание. Установлено, что в ранний период (3 ч) после операции скорость потребления кислорода в гомогенате печени в различных метаболических состояниях увеличена (рис.4). При этом наблюдаются признаки активации сукцинат- и НАДН-оксидазных систем (Уз и Ур-оксибутират+малонат+днф). Аналогичные сдвиги регистрируются через 24 ч и в меньшей
Время поел* ЧГЭ, часы 1 — С — 2 А 3 К 4 —Ж—Б » Т]
Рис. 4 Динамика показателей окислительного метаболизма в регенерирующей печени (% от контроля).
1 - эндогенное дыхание; 2 • УЗ; 3 - V Р-ОН + мад.+ днф; 4 - малонат-чувствнтельное дыхание; 5 - амиталчувствительное дыхание; б - амитал-мапонатрезистентное дыхание
степени через 36 ч , но не через 12 ч . Во все исследованные сроки в печени повышается содержание эндогенных энергетических субстратов, о чем можно судить по величине дыхания гомогената в присутствии разобщителя ДНФ. Причем,возрастает малонатчувствительное дыхание, особенно через 3, 24 ч и в меньшей степени через 12 и 36 ч , что свидетельствует об увеличении количества и вклада эндогенного сукцината в энергетический метаболизм регенерирующей печени в эти периоды. Во все сроки за исключением 12 ч повышается амиталмалонат- резистентное дыхание гомогената в присутствии ДНФ, что отражает усиление окисления липидов в ткани в этих условиях. Анализ измерений Ре2+-индуцированной хемилюминесценции в гомогеиате регенерирующей печени показывает, что изменения в системе ПОЛ-АОА в течение развития первой наиболее синхронизированной волны пролиферации носит двухфазный характер: активация ПОЛ, а также снижение АОА в течение первых 3 ч после Ч£Э и снижение ПОЛ с повышением АОА и окисляемосги
липидов в последующем (рис.5). Изменения концентрации ГАГ в регенерирующей печени имеют также фазный характер (рис.6). В пре-репликатизный период (3 ч) кГАГ снижаются, а в синтетический (24 ч), напротив,повышаются. Во время развития волны митозов 36 ч после ЧГЭ) кГАГ вновь снижаются. При этом содержание нГАГ я ткани практически*не изменяется. 1
Срок поел* частичной галггэктеюи, чае
Рис. 5 Изменение показателей Яе2+ -индуцированной хемилюминесценции в динамике регеяер;щии печени (% от контроля).
Дыхание клеток КМ в постгеморрагическом периоде стимулируется, особенно через 1 сутки после операции (V энд +117.9%, V як +163.1%, V днф як +78.4% р<0.05). При этом общий фонд эндогенных субстратов меняется мало, но заметно усиливается окисление липидов (амиталмалонатрезистентное дыхание +277.6% р<0.05) при сокращении количества НАД-зависимых субстратов (амитал чувствительное дыхание - 51.7%). В миелокариоцитах вместе с пер-
Время после ЧГЭ. часы
В Нейтральные □ Кислые
Рис.6 Изменение содержания гликозамингликаноа в динамике регенерации печени (% от контроля).
воначальным повышением ПОЛ наблюдается прогрессирующее увеличение АОА к моменту наибольшей пролиферативной активности в КМ. Через 24 ч после индукции регенерации в клетках обнаруживается увеличение процента свободной активности лизосомальных ферментов. Позднее (через 3 и 5 суток) стабильность мембран лизосом нарастает, вместе с тем свободная активность ферментов в миелокариоцитах через 3 суток повышена (+40.6%). После кратковременного и незначительного возрастания содержания кГАГ (+12.7% р<0.05) и снижения нГАГ (-26.7% р<0.05) в КМ в первые часы (2 ч) после кровопускания, через 24 ч развивается выраженное падение кГАГ (-85.9% р<0.05) и повышение иГАГ (+60.4% р<0.05). Через 3 суток после операции повышенным оказываются содержание как кГАГ, так и нГАГ (соответственно +59.0%« +44.2% р<0.05).
Сопоставление сдвигов, выявленных в ключевые моменты индуцированной регенерации и в динамике охлаждения дает основание полагать, что изменения метаболических параметров в ткани при действии экстремального -фактора если не индуцируют, то способствуют активации регенераторных процессов.
В специальных сериях экспериментов показано, что воздействие на энергетический метаболизм путем введения животным сукцината и глутамата активирует пролиферативные процессы в регенерирующей печени. Регенерация в печени стимулируется припроведении ЧГЭ на фоне повышения АОА в результате введения ионола, а на фоне повышения ПОЛ после повторных инъекций железо-аскорбатной смеси - угнетается. Предварительная лабилизация лизо-сом с помощью хлороквина усил1шала кобальтовую стимуляцию эритропоэза, а тахже ускоряла постгеморрагическое восстановление красной крови. Вместе с тем введение только хлороквина не влияло на гематологические показатели.
Свидетельством сопряженности метаболических факторов и характера адаптивного роста является тот факт, что угнетение процессов репаративной регенерации в печени при кратковременном холодовом воздействии сопровождается дефицитом сукцината через 3 и 24 ч после ЧГЭ (малонатчувстви-тельное дыхание -32.8% и -19.3% соответственно), а также более выраженной, чем у контрольных животных активацией липолиза, способствующей ингибированию окислительных систем и снижению энергизаДии митохондрий. Амиталмалонатрезистентное дыхание возрастает через 3 ч после ЧГЭ на 40.2%, через 12 ч - на 197.1%, через 24 ч - на 179.5% и через 36 ч - на 66.7% (для всех сроков р<0.05). У животных этой экспериментальной группы в печени извращается динамика активности лизосоиального аппарата и содержания кГАГ и нГАГ. В тканевых препаратах отмечаются признаки активации ПОЛ в ранние часы (через 3 ч 1 - 16.4%, 1§а +59.4%, Ь' +17.5% р<0.05) и неустойчивости этих процессов в последующем, уменьшения АОА, а также удлинения начальной фазы сниженнной окисляемости липидов. При продолжительном холодовом воздействии в регенерирующей печени значительно увеличивается активность лнзосомальных ферментов в ранние послеоперационные часы (общая активность КФ - +75.8%, свободная - +60.6% р<0.05), стимулируется ПОЛ ^а возрастает через 3 ч на 218.5%, 12 ч - на 33.0% и 24 ч - на 144.9%) одновременно с некоторым снижением окисляемости липидов, т.е. наблюдаются сдвига, характерные для периода индукции пролиферации. Вместе с тем в ранние часы отмечается дефицит эндогенных энергетических субстратов (-37.2% р<0.05), который позднее сменяется их увеличением, особенно сукцината (+56-86% р<0.05). В ткани возрастает активность окислительных систем. Содержание ГАГ приближается к контрольным значениям. Столь разнонаправленное действие метаболических факторов на пролиферацию сопрово-
ждается рассинхронизацией клеточного ответа с ускорением прохождения частью клеток фаз митотнческого цикла.
Нарушение восстановительных процессов в системе крови при продолжительном воздействии низкой температуры развивается при угнетении дыхательной активности миедокариоцитов (-10-60% в разные-сроки исследования), снижении на 12-40% содержания эндогенных субстратов и их утилизации в том числе сукцнната и особенно яипидов (-28-55%). В КМ нарастает лабильность лизосомальных мембран с повышением свободной активности ферментов. Извращается динамика в системе ПОЛ-ЛОЛ: отсутствует повыше/;.¡е ПОЛ в период активного запуска пролиферации (через 1 сутки после кровопускания), значительно увеличивается АОА. В т кани резко нарушается метаболизм ГАГ -сдвиг, характерный для первых часов гюсттеморрагического периода (снижение и ГАГ и новы-шение кГАГ) сохраняется до 6 суюк.
Из полученных фактов следует, что в условиях действия экстремальных факторов регенераторный ответ на повреждение зависит в значительной степени от состояния метаболюма в ткани в динамике послеоперационного периода. Вместе с тем определенное значение в этом принадлежит состоянию метаболических процессов непосредственно перед нанесением регенераторног о стимула. Об >гом свидетельствуют эксперименты, в которых животные подвергались холодовому воздействию только до операции, а в послеоперационном периоде содержались в тепле.
Тесная взаимосвязь метаболических факторе делает возможным не только их прямое влияние на регенераторные процессы, но и опосредованное действие. Так, нами установлено, что энергетический митохондриальный аппарат кроме обеспечения клеток энергией и контроля за важнейшим внутриклеточным мессеиджером - Са2+, участвует в регуляции ПОЛ путем генерации алтиоксидантов в зависимости от своего функционального состояния. В опытах in vitro показаны зависящие от концентрации про- н антиокендантные свойства ГАГ. По-видимому, ГЛГ, модулируя действие активных фсрм кислорода во внеклеточном, примембранном пространстве, через процессы свобод-норадикального окисления влияют на биомембраны. В свою очереда.,стимуляция свободнорадикального окисления может влиять на концентрацию ГАГ приводя нх структур;,! к изменению, облегчающему гидролиз, а также путем активации лизосомального аппарата.
3. Особенности регенераторных и метаболических процессов в тканях животных, обитающих в различных климато-географических условиях,и их изменение при холодовом воздействии.
Данные, полученные нами при исследовании животных из природных популяций, свидетельствуют о важной адаптивной роли формировшшя нового морфо-функцнонального состояния ткани. Особенности процессов адаптивного роста у животных, обитающих на Севере, можно рассматривать как оптимальный пДриант приспособительной перестройки.
У красных полевок северной популяции в печени выше содержание ДНК, меньше интенсивность включения Зн-тимидина в ДНК, ниже средняя плоид-ность гепатоцитов за счет снижения количества высокоплоидных клеток при некотором росте двуядерных, по сравнению с животными из средней полосы (табл. 2). У леммингов - представителей узкоспециализированного северного вида, при таком же уровне синтеза ДНК в печени еще ниже плоидность гепатоцитов и наименьший среди всех исследованных животных уровень двуядерных клеток.
В периферической крови представителей Севера выше уровень гемоглобина и эритроцитов, но в то же время ниже содержание ретикулоцитов. В КМ у этих животных меньше общий пул кроветворных клеток, объем эритроидного ростка и количество эритроидных клеток синтезирующих ДНК, индекс созревания эритробластов. Такое сочетание показателей может свидетельствовать о повышении активности эритропоэза у северных животных, за счет более высокой пролиферативной активности эритрокариоцитов и скорости созревания эритроидных клеток.
Прослеживается определенный параллелизм между изменениями у экспериментальных животных при продолжительном действии холода и особенностями регенераторных процессов у северных животных - снижение плоидности гепатоцитов, сокращение объема эритроидного ростка, что указывает на адаптивный характер этих сдвигов.
Показатели регенераторных процессов в тканях у животных, обитающих в различных климато-географических условиях.