научная статья по теме ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИИ ПРОТЕАСОМ ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ДОНОР-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ У КРЫС ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ ЯИЧНИКА Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИИ ПРОТЕАСОМ ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ДОНОР-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ У КРЫС ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ ЯИЧНИКА»

ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2012, № 3, с. 296-302

ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИИ ПРОТЕАСОМ ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ДОНОР-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ У КРЫС ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ТКАНИ ЯИЧНИКА

*Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 **Институт проблем криобиологии и криомедицины НАНУкраины, 61015Харьков, ул. Переяславская, 23 E-mail: yasiiik@gmail.com Поступила в редакцию 08.09.2011 г.

Индукция донор-специфической толерантности у реципиента является одним из методов решения проблемы приживления транплантатов эндокринных желез без применения иммунодепрессантов, нарушающих гормон-продуцирующую функцию. В настоящей работе исследованы изменения, затрагивающие пул протеасом в печени, селезенке и трансплантате крыс в развитии донор-специфической толерантности после введения спленоцитов донора в портальную вену реципиента и последующей аллотрансплантации ткани яичника под капсулу почки. Обнаружено, что сдвиг баланса в пуле протеасом печени и трансплантата в сторону увеличения уровня форм, содержащих субъединицу LMP2, определяет развитие иммунологической толерантности и приживление трансплантата. Напротив, увеличение количества форм, содержащих субъединицу LMP7, обусловливает развитие иммунного ответа и отторжение трансплантата.

Трансплантация ткани яичника является эффективной стратегией сохранения фертильности и эндокринной функции у женщин, подвергшихся радио- и химиотерапии, используется при синдроме истощенных яичников, дисгенезии гонад, а также для продления репродуктивного возраста (Грязнова и др., 1983; Donnez et al., 2007; Dittrich et al., 2010). Однако при пересадке аллогенных органов/тканей активируется иммунная система реципиента, и запускается процесс острого отторжения (Roitt, Delves, 2007). Применение им-муносупрессии при трансплантации тканей эндокринных желез является нежелательным, так как может нарушить их гормон-продуцирующую функцию (Shushan, Schenker, 1992; Johnson et al., 2009), поэтому внимание исследователей привлекает возможность индукции специфической толерантности к трансплантату.

Донор-специфическую толерантность (ДСТ) к трансплантату можно индуцировать путем введения донорских клеток (мононуклеаров периферической крови, клеток лимфоузлов, селезенки, костного мозга, мезенхимальных стволовых клеток) в портальную вену печени за 7—14 сут до трансплантации органа или ткани от того же донора (Crispe et al., 2006). Эффект ДСТ был показан при аллотрансплантации целых органов (почки, сердца, печени), тканей (кишечника, кожи, периферического нерва) и островков поджелу-

дочной железы (Ikebukuro et al., 2002; Iwata et al., 2002; Oko et al., 2002; Sato et al., 2003; Sheng Sun et al., 2005; Tung et al., 2006; Casiraghi et al., 2008). Механизм развития такой толерантности до конца не выяснен, однако предполагается, что важную роль в этом случае играет система регуляции иммунного ответа в печени, где предпочтительнее развивается не защитная иммунная реакция, а иммунологическая толерантность (Crispe et al., 2006). В основе явления толерантности печени к антигенам лежат особенности процесса презентации антигена иммунными клетками печени, в частности, клетками Купфера и эндотелиальны-ми клетками печеночного синусоида (Parker et al., 2005).

Вместе с тем, изучение молекулярных механизмов формирования иммунологической толерантности необходимо для понимания сути процесса в целом. Не исключено, что некоторые участники развития иммунных реакций, в частности, иммунные протеасомы, могут играть ключевую роль в организации специфического иммунитета печени. Протеасомы — это внутриклеточные высокомолекулярные белковые комплексы, осуществляющие избирательную деградацию белков (Arrigo et al., 1988). Иммунные протеасомы, в свою очередь, участвуют в образовании антигенных эпитопов, способных присоединяться к молекулам главного комплекса гистосовмести-

Введение Овариоэктомия и Окончание

спленоцитов трансплантация эксперимента

Рис. 1. Схема индукции донор-специфической иммунологической толерантности.

мости класса I, и выполняют ключевую роль в Т-клеточном иммунном ответе (Rock, Goldberg, 1999; Sharova, Zakharova, 2008). Ингибитор активности протеасом бортезомиб применяется в трансплантологии в качестве иммуносупрессанта (Everly etal., 2009), что свидетельствует о возможности регуляции иммунной реакции на трансплантат путем модификации протеасомного пула.

Цель работы — исследование экспрессии иммунных протеасом и общего пула протеасом, а также его протеолитической активности в печени, селезенке и аллотрансплантате ткани яичника у крыс после индукции ДСТ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты были проведены на 3-4-месячных крысах самках линий Вистар и Август. Донорами являлись крысы линии Вистар, реципиентами — линии Август. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с положениями " Европейской конвенции защиты позвоночных животных, которые используются с экспериментальной и иной научной целью" (Страсбург, 1985).

Овариоэктомию крысам линии Август осуществляли по ранее описанному методу (Кабак, 1968). Неонатальные яичники (0-5-е сут постна-тального развития) получали от крыс линии Ви-стар. Яичники отмывали 3—4 раза физиологическим раствором и трансплантировали под капсулу левой почки крысам линии Август (2 яичника на одного реципиента) непосредственно после овариоэктомии.

Спленоциты получали из селезенки крыс линии Вистар (Лимфоциты: Методы, 1990). От эритроцитов избавлялись путем трехкратной обработки клеточной суспензии раствором, содержащим 154 мМ хлорида аммония, 10 мМ бикарбоната натрия, 0.082 мМ этилендиаминтетраук-сусной кислоты. Жизнеспособность полученных клеток, которую проверяли методом суправи-тального окрашивания трипановым синим, составляла в среднем 90%. Животным группы с индукцией ДСТ за 7 сут до трансплантации в портальную вену печени вводили 1 мл физиологического раствора, содержащего спленоциты в количестве 1 х 107 клеток. Исследование трансплантатов и органов проводили на 30-е сут после трансплан-

тации (рис. 1). В экспериментах использовали несколько групп животных: 0-я группа — интактный контроль, 1-я группа — ложнооперированные животные (введение чистого физиологического раствора интрапортально и имитация трансплантации), 2-я группа — с интрапортальным введением спленоцитов и последующей трансплантацией ова-риальной ткани под капсулу почки, 3-я группа — с трансплантацией овариальной ткани под капсулу почки без предшествующей индукции ДСТ, 4-я группа — овариоэктомированные животные.

Эстрадиол и прогестерон измеряли радиоиммунологическим методом с помощью тест-наборов РИА-Эстрадиол-СТ и РИА-Прогестерон-СТ (Беларусь).

Для гистологического анализа почки с трансплантатами были зафиксированы в 10%-ном формалине и залиты в парафин. Серийные срезы толщиной 5 мкм окрашены гематоксилином и эозином.

Использовали комбинированные мышиные моноклональные антитела к субъединицам а1, 2, 3, 5, 6, 7, мышиные моноклональные антитела к субъединице а5, к субъединице LMP2 (p1i), кроличьи поликлональные антитела к субъединице LMP7 (p5i) протеасом фирмы Biomol (Великобритания); анти-мышиные и анти-кроличьи антитела IgG, меченные пероксидазой, фирмы Amersham Biosciences (Великобритания); субстраты протеасом: N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr7-amido-4-methyl coumarin (Suc-LLVY-AMC) (Sigma, США) и Z-Leu-Leu-Glu-amido-4-methyl coumarin (Z-LLE-AMC) (Tebu-Bio, Бельгия), и ингибиторы протеасом: Z-leucyl-leucyl-leucinal (MG132) (Sigma) и adamantaneacetyl-(6-aminohexanoyl)3-(leucyl) 3 - vinylmethyl- sulfone (AdaAhx( 3) L( 3) VS) (Enzo, Великобритания).

Все процедуры проводили при 4°C. Пробы печени, селезенки, трансплантатов и неонатальных яичников гомогенизировали в гомогенизаторе стекло—стекло в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl (pH 7.5), 100 мМ NaCl, 1 мM этиленди-аминтетрауксусной кислоты, 1 мМ дитиотреитол, 10% глицерин, 10 мМ Na2S2O5, лейпептин (0.5 мкг/мл), пепстатин (1 мкг/мл), апротинин (1 мкг/мл), в соотношении 1 : 3 (масса : объем). Гомогенаты центрифугировали при 15400 g в течение 30 мин. Полученные супернатанты (осветленные гомогенаты) использовали в последую-

Уровень эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови экспериментальных животных на 30-е сут после трансплантации

Группа крыс Обработка Эстрадиол, (нмоль/л)10 2 Прогестерон, нмоль/л

0 Интактный контроль 34.6 ± 5.4 83.3 ± 15.3

2 Спленоциты (интрапортально на 1-е сут), 15.4 ± 5.1 61.4 ± 11.9

овариоэктомия и трансплантация (7- е сут)

3 Овариоэктомия и трансплантация (7 -е сут) 7.5 ± 4.3* 39.3 ± 3.1

4 Овариоэктомия 7.9 ± 1.7* 10.7 ± 2.5*

: Уровень гормона достоверно отличается от контроля,р < 0.05.

щих исследованиях. Тотальный белок определяли в осветленных гомогенатах по методу Лоури (Lowry гг а1., 1951).

Химотрипсин- и каспаза-подобную активности протеасом определяли по гидролизу флуоро-генных пептидов Suc-LLVY-AMC и Z-LLE-AMC соответственно. Реакционная смесь содержала 20 мМ трис-НО (рН 7.5), 1 мМ дитиотреитол, 5 мМ М§С12, 1 мМ АТФ и 60 мкМ Suc-LLVY-AMC или 15 мкМ Z-LLE-AMC. Реакцию проводили при 37^ в течение 20 мин после добавления 0.5— 2 мкл пробы осветленного гомогената в реакционную смесь (до конечного объема 100 мкл) и останавливали 1%-ным раствором додецилсуль-фата натрия. Флуоресценцию образца измеряли на флуориметре при длине волны возбуждения 380 нм и длине волны испускания 440 нм. Для оценки активности примесных протеаз использовали ингибитор химотрипсин-подобной активности протеасом, MG132, и ингибитор каспаза-по-добной активности протеасом, AdaAhx(3)L(3)VS. Первоначально эффективную концентрацию этих ингибиторов определяли на протеасомах, выделенных из печени взрослых крыс и очищенных от примесей других протеаз по методу, описанному ранее (Абрамова и др., 2004). MG132 полностью ин-гибировал химотрипсин-подобную активность в концентрации 5мкМ, AdaAhx(3)L(3)VS вызывал ма

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎