научная статья по теме ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ТИМОЦИТОВ IN VIVO И IN VITRO У ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА Биология
Текст научной статьи на тему «ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ТИМОЦИТОВ IN VIVO И IN VITRO У ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА»
ОСОБЕННОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ТИМОЦИТОВ IN VIVO И IN VITRO У ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ
Логинова Н. П., Шилов Д. Ю., Годовалов А. П., Шилов Ю. И., Лебединская О. В., Четвертных В. А.
ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера»
Минздрава России, Пермь, Россия
С помощью иммуногистохимического и ультратонкого методов исследования у детей с врожденными пороками сердца при исследовании in vivo установлено снижение пролиферации тимоцитов в сочетании с нестабильной и дистрофически измененной структурой ретикулярных эпителиоцитов. В условиях in vitro в группе больных детей отмечается статистически значимое усиление отвечаемости лимфоцитов на митоген, что, возможно, связано с костимулирующим эффектом клеточного стресса в ответ на повреждение клеток гипоксией, вызванной врожденным пороком сердца.
Ключевые слова: тимус, пролиферация, ретикулярные эпителиоциты, врожденный порок сердца, лимфоциты
Введение. Тимус как первичный орган иммунной системы отвечает за антигеннеза-висимую дифференцировку Т-лимфоцитов и формирование рециркулирующего пула этих клеток. В кортикальной зоне тимуса происходят формирование клонального разнообразия Т-лимфоцитов, процессы положительной и отрицательной селекции клонов с формированием толерантности к "своему" и функциональной гетерогенности Т-клеток [1, 2, 8]. Пролиферация тимоцитов, интенсивность которой наиболее высока в кортикальной зоне тимуса, - неотъемлемый процесс, связанный с внутритимическим созреванием Т-лимфоцитов. В настоящее время известно несколько ядерных и мембранных антигенов, изменение экспрессии которых связано с пролиферацией клеток. Одним из наиболее изученных молекулярных биомаркеров про-лиферативной активности является К 67, антитела к которому реагируют с клетками, находящихся в G1, Б, М, G2 стадиях клеточного цикла. Если клетка не пролиферирует, такого взаимодействия не происходит [1, 8].
Известно, что на судьбу тимоцитов определяющее влияние оказывает прямой мембранный контакт с ретикулярными эпителиоци-тами. Последние, соединяясь отростками, образуют трехмерный каркас, сеть и являются
основным компонентом микроокружения тимоцитов. Они служат источником стимулов к пролиферации и дифференцировке тимоцитов в процессе положительной и отрицательной селекции [1, 2, 5, 9]. Взаимоотношения этих клеток являются реципрокными [1, 2]. Практически все клетки эпителиальной стромы тимуса регулируют процессы вну-тритимической активации, пролиферации, дифференцировки, апоптоза Т-лимфоцитов либо за счет короткодистантных взаимодействий при участии цитокинов, гены которых экспрессируются конститутивно, либо под влиянием прямых межклеточных контактных лиганд-рецепторных взаимодействий.
Стрессовые факторы, такие как ишемия, гипоксия, вирусная инфекция влияют на проли-феративную активность лимфоцитов и дальнейшие этапы их развития. Так, тканевая гипоксия, вызванная нарушением системной гемодинамики на фоне врожденных пороков сердца (ВПС), приводит к инволютивным изменениям в тимусе [4].
Цель работы - исследование особенностей пролиферации тимоцитов in vivo и in vitro у детей с врожденными пороками сердца.
Материал и методы. Исследование проводили на биоптатах тимуса, полученных во время операций от детей в возрасте до 11 мес. жизни
при коррекции ВПС. Тимэктомия проводилась в соответствии с существующей хирургической практикой Федерального краевого центра сердечнососудистой хирургии г. Перми. Исследования проводили согласно Хельсинской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. Критериями включения явилось наличие добровольного согласия на обследование со стороны законных представителей несовершеннолетних. В эксперименте in vivo выделено 2 группы: 1-я - тимус (n=25) детей с ВПС, в возрасте до 1 года; 2-я - группа сравнения, тимусы от случайно погибших детей, в возрасте до 1,5 лет (n=12). Для эксперимента in vitro также были выделены 2 группы: 1-я -тимус (n=10) детей ВПС; 2-я - тимусы (n=8) детей, группа сравнения.
Биоптаты тимуса фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,2). Иммуногистохимическое исследование проводили на серийных срезах с монокло-нальными антителами к эпителию: панцито-кератину AbsAE1/AE3 (PanCK), включающий в себя широкий спектр цитокератинов, специфически реагирующих с нейтральными и кислыми кератинами эпителиальных клеток; пролиферативную активность изучали с применением меченых антител к белку Ki-67 (in vivo). Визуализацию результатов проводили с использованием системы детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer. Инкубировали с хромогеном - DAV Plus Substrate System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в БиоМаунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (Labvision, США).
Для получения полутонких срезов кусочки тимуса размером 1-2 мм3 фиксировали в 10% растворе глютарового альдегида и 1% растворе OsO4, дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в аралдитовые смолы. Готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуиди-новым синим.
Поликлональный пролиферативный ответ Т-лимфоцитов оценивали в культурах (2х105 клеток на 0,2 мл 96-луночного планшета) с кон-канавалином А (Concanavalin A from Canavalin ensiformis, Sigma, США) в концентрациях 40, 20, 10, 5 и 2,5 мкг/мл или без него в среде 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES (Sigma,
США), 100 мкг/мл гентамицина сульфата и 10% сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Россия). Через 48 ч культивирования во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С вносили по 2 мкКи метил-3Н-тимидина. Через 24 ч уровень радиоактивности в кислотонерастворимой фракции оценивали на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Guardian" WinSpectral DSA 1414-03 («Wallac», Финляндия) в подразделении радиоизотопных исследований лаборатории биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН.
Анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики, од-нофакторного дисперсионного анализа и апостериорного LSD-теста для парных данных. Различия между двумя группами оценивали с помощью непарного варианта t-критерия Стьюдента. Данные по включению метил-3Н-тимидина с учетом их log-нормального распределения предварительно преобразовывали в значения log10 имп/мин. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение. При изучении пролиферативной активности тимоцитов пациентов с ВПС в условиях in vivo, положительная экспрессия Ki 67 выявлялась в диффузно расположенных клетках в пределах всей дольки тимуса.
При сравнении двух групп детей доля ти-моцитов, экспрессирущих Ki 67, статистически в обеих группах отличалась и составляла 51,0±2,2% у пациентов группы ВПС и 72,2±3,1% у детей группы сравнения. На полутонких срезах выявляются значительные дистрофические изменения тимусного эпителия с явлениями гибели клеток. Формируются зоны опустошения. Все это, на наш взгляд, вызывает снижение пролиферации у детей с ВПС в связи с задержкой пролиферации тимоцитов из-за выраженного процесса деструкции эпителиальных клеток стромы.
Уникальной особенностью ретикулярных эпителиоцитов является наличие в цитоплазме цитокератин-промежуточных филаментов, появляющиеся на этапе их дифференцировки [6, 7, 10]. Качество сборки промежуточных фила-ментов влияет на механическую стабильность и целостность эпителия. Для верификации в тимусе стромального компонента использовали антитела к PanCK. В корковом веществе долек PanCK в эпителиальных клетках между группами выявляется с разной интенсивностью. У детей группы сравнения в пределах коры дольки
Группа с ВПС Группа сравнения
Рис. Пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса в культурах с Кон А. По оси ординат приведены значения M±m для показателей log10 имп/мин, а сверху, над столбиками - средние геометрические имп/мин (антилогарифм из M log10 имп/мин). * - p<0,05 по парному критерию LSD по отношению к культуре без митогена.
эпителиальные клетки, соединяясь отростками, формируют подобие сети (кластеры), контактируя с лимфоцитами на этапе их развития.
При сердечных пороках положительная экспрессия PanCK резко снижена, выявляется эпизодически, фрагментарно или вообще отсутствует. В части долек сеть местами нарушена, клетки между собой теряют контакт, что приводит к формированию изолированных скоплений эпителиальных клеток. В полутонких срезах эпителиальные клетки имеют признаки дистрофических изменений, приводящие к потерям межклеточной связи, и как следствие, формированию зон клеточной дезорганизации.
Снижение экспрессии PanCK в ретикулярных эпителиоцитах проявляется нарушением целостности эпителиальной сети стромы тимуса и коррелирует с пролиферацией тимоци-тов в условиях in vivo. При оценке пролифера-тивного ответ в культуре клеток (in vitro) при действии митогена (Кон А) установлено, что статистически значимое усиление пролиферации лимфоцитов в культурах с Кон А в концентрации 5 и 10 мкг/мл в сравнении с культурами без митогена наблюдается только при культивировании тимоцитов детей с ВПС (рис.).
Возможно, это связано с костимулирую-щим эффектом клеточного стресса в ответ на повреждение клеток гипоксией, т. к. для ти-моцитов в отличие от зрелых Т-лимфоцитов характерна низкая отвечаемость на мито-гены. При оценке пролиферативного ответа в культурах тимоцитов у детей с ВПС по отношению к группе сравнения статистически значимых различий по непарному
t-критерию Стьюдента не выявлено (p>0,05).
Таким образом, установлено, что для ВПС характерно снижение пролиферации тимоцитов в сочетании с нестабильной и дистрофически измененной структурой ретикулярных эпители-оцитов при исследовании in vivo. В условиях in vitro в группе детей с ВПС отмечается статистически значимое усиление отвечаемости лимфоцитов на митоген, что, возможно, связано с ко-стимулирующим эффектом клеточного стресса в ответ на повреждение клеток гипоксией.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 11-04-96023 р_урал_а).
1. Кветной И. М., Ярилин А. А
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.