научная статья по теме 1-амино-2-(4-гидроксифенил)этилфосфонистая кислота новый субстрат тирозин-фенол-лиазы Химия

Текст научной статьи на тему «1-амино-2-(4-гидроксифенил)этилфосфонистая кислота новый субстрат тирозин-фенол-лиазы»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ¡997, том 23, № 11, с. 919-921

1-АМИНО-2-(4-ГИДРОКСИФЕНИЛ)ЭТИЛФОСФОНИСТАЯ КИСЛОТА НОВЫЙ СУБСТРАТ ТИРОЗИН-ФЕНОЛ-ЛИАЗЫ

Институт, молекулярной биологии 1Ш. В.А. Энгельгардта ¡'АН, 117984, Москва, ул. Вавилова, 32; * Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва; **Институт биохимии им. А Н. Баха РАН, Москва Поступила и редакцию 19.06.97 г. Принята к печати 21.07.97 г,

Фосфонистые аналоги тирозина и пирувата являются субстратами реакций элиминирования и синтеза, катализируемых пиридоксаль-5'-фосфатзависимой тирозин-фенол- лиазой.

Ключевые слова: 1-амиио-2-(4-гидроксифенил)этилфосфонистая и 1 -оксоэтилфосфонистая лоты, тирозин-фенол-л и аза.

(I) R = Alk, X = Н или ОН (Ia) R = 4-НОС6Н4СН2; X = Н (16) R = 4-НОС6Н4СН2; X = ОН

или ОН (IIa) R = СН3; X = Н

Для PLP-зависимых ферментов, играющих ключевую роль в превращениях аминокислот, известно несколько работ по конкурентному торможению аминофосфоновыми кислотами (I; R = Alk, X = ОН) ферментативного переаминирования и декарбоксилирования [2,3]. Низкое сродство аналогов к ферментам было связано с очевидными различиями (Н0)2(0)Р- и НООС-групп в геометрии, размерах и основности. Эти различи;! были менее выражены для аминофосфонистых кислот (I; X = Н), которые рассматриваются как близкие аналоги природных аминокислот [4, 5]. Так, фос-фонистый аналог аланина является конкурентным обратимым ингибитором бактериальной PLP-зависимой рацемазы аланина, что обусловливает его антибактериальную активность [6]. Впервые возможность субстратных превращений кислот (I) в PLP-зависимых реакциях была показана

Сокращения: PLP- пиридоксаль-5'-фосфат, ТР-лиаза -розин-фенол-лиаза. # Автор для переписки.

на примере аспартатаминотрансферазы, а также фосфоновых и фосфонистых аналогов аспараги-новой и глутаминовой кислот [7]. Возможность РЬР-зависимых внутриклеточных превращений предполагалась и для фосфонистого аналога аланина - нового ингибитора биосинтеза меланина у фитопатогенных грибов [8].

До сих пор не было исследовано взаимодействие аналогов кислот (I) с большой и важной группой РЬР-зависимых лиаз, что могло бы открыть новые возможности для воздействия на обмен аминокислот и для понимания роли НООС-груп-пы субстратов в механизме действия РЬР-зависимых ферментов.

В данной работе впервые показано, что субстратом РЬР-зависимой лиазы является фосфо-нистый аналог тирозина (1а), который также образуется в результате обратной ферментативной реакции.

Тирозин-фенол-лиаза (ТР-лиаза; КФ 4.1.99.2) -микробный РЬР-зависимый фермент, катализирующий расщепление ¿-тирозина или его замещенных го ароматическому ядру анал< >гов до ■ ирува-та аммония и соответствующих фенолов. ТР-лиаза используется и для ферментативного синтеза тирозина и его аналогов; субстратами обратной реакции служат некоторые замещенные в ядро фенолы и пируват аммония [9, 10]:

Рис. 1. Образование 1-оксоэтилфосфонистой кислоты из 1-амино-2-(4-гидроксифенил)этилфосфонистой кислоты под действием ТР-лиазы. Скорость реакции определяли по образованию (IIa), количественное определение которой проводили по реакции с 2,4-динит-рофенилгидразином согласно [19]. (а) - зависимость скорости реакции от pH. Реакцию проводили 22.5 ч при 25° С в 0.1 М натрий-боратных буферах в общем объеме 2 мл при концентрации аминокислоты (1а) 15 мМ, PLP 0.1 мМ и ТР-лиазы 0.5 ед. акт./мл; (б) - зависимость начальной скорости реакции от концентрации кислоты (1а). Условия реакции как на рис. la; pH 9.0, концентрация ТР-лиазы 0.24 ед. акт./мл, время 3.5 ч.

Общепринятый механизм действия ТР-лиазы включает образование "внешнего" альдимина между коферментом PLP и аминогруппой субстрата, отщепление а-протона, таутомеризацию фенольного фрагмента и его последующее элиминирование [9, 10].

Исследована субстратная специфичность фермента и способность его катализировать обмен (Х-водорода у многих аминокислот, не являющихся истинными субстратами ТР-лиазы [11]. О значении НООС-группы субстрата известно лишь то, что амиды аминокислот не являются субстратами лиазной реакции Ц1|. Связывание НООС-груп-пы в активном центре ТР-лиазы достигается за счет электростатического взаимодействия с остатком Arg404 [12], что наблюдается и для других PLP-зависимых ферментов [13, 14]. Роль пространственного строения кислотной группы субстрата в обеспечении фермент-субстратного соответствия для PLP-зависимых лиаз до настоящего времени не исследовалась.

ТР-лиазу из клеток Citrobacter intermedius получали согласно [15], рацемическую 1-амино-2-(4-гидроксифенил)этилфосфонист>ю кислоту (1а) синтезировали как описано ранее [16], а 1-оксо-этилфосфонистую кислоту (IIa) - по [17].

Взаимодействие ТР-лиазы с кислотой (1а) в 0.1 М калий-фосфатном буфере (pH 8.0), оптимальном для реакции фермента с природным субстратом, приводит к образованию фенола и фос-фонистой кислоты (На), которая была идентифицирована в виде 2,4-динитрофенилгидразона по методике [18].

Следует отметить, что в аналогичных условиях действие ТР-лиазы на рацемическую 1-амино-2-(4-гидроксифенил)этилфосфоновую кислоту (16), полученную по методике [16], приводило лишь к следовым количествам фенола.

При увеличении рН наблюдалось резкое возрастание скорости ферментативного расщепления кислоты (1а), которая достигала максимума в интервале рН 9.0-9.5 (рис. 1а), а при увеличении рН до 10.0 скорость реакции несколько снижалась. Таким образом, рН-оптимум для реакции ТР-лиазы с кислотой (1а) значительно сдвинут в сторону более высоких значений рН по сравнению с таковым для природного субстрата.

Зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 16) имеет гиперболический характер и описывается уравнением Михаэлиса-Ментен с Кт, равной 2.16 мМ. Поскольку с большой степенью вероятности можно предполагать, что субстратом фермента является лишь один из энантиомеров рацемата (1а), то значение Кт для этого "активного" энантиомера должно быть в 2 раза меньше (1.08 мМ), что всего лишь в 4.3 раза выше по сравнению с Кт для Ь-ти-розина, равной 0.25 мМ [20]. В то же время значение &кат для аналога (1а), наблюдаемое при оптимальном рН, в 440 раз ниже, чем для ¿-тирозина.

При действии ТР-лиазы на реакционную смесь, содержащую фенол, кетофосфонит (Па) и аммиак, наблюдалось образование аминофосфонита (1а). Динамику накопления этого продукта (рис. 2) исследовали методом ТСХ. Начальная скорость синтеза была в 5 раз выше по сравнению с величиной £кат для реакции расщепления. Образующийся продукт был выделен ионообменной хроматографией, и его ПМР-спектр оказался идентичен спектру кислоты (1а), синтезированной химически. Следовательно, ТР-лиаза способна катализировать не только а,(5-элиминирование в кислоте (1а), но и обратный процесс, в котором субстратом является фосфонистый аналог пирувата (На):

Таким образом, впервые для РЬР-зависимой лиазы показано, что фосфонистые аналоги тирозина и пирувата являются субстратами реакций элиминирования и синтеза. Определены кинетические параметры ферментативного процесса и впервые осуществлен ферментативный синтез аминофосфонистой кислоты. Показано, что замена в молекуле субстрата планарной НООС-группы на Н(0Н)(0)Р-группу, имеющую тетраэдричес-

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎