научная статья по теме АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПСЕВДОФИТОХЕЛАТИНОВОГО ГЕНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА Биология

Текст научной статьи на тему «АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПСЕВДОФИТОХЕЛАТИНОВОГО ГЕНА В РАСТЕНИЯХ ТАБАКА»

АКТИВНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПСЕВДОФИТОХЕЛАТИНОВОГО

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и генетики УНЦРАН, Уфа

Поступила в редакцию 08.03.2011 г.

При создании трансгенных растений, пригодных для использования в фиторемедиации загрязненных тяжелыми металлами почв, сконструирован de novo и клонирован синтетический псевдофито-хелатиновый ген, кодирующий аналог фитохелатина с формулой Met(GluCys)6Gly. Этот пептид, в отличие от природных фитохелатинов, синтезирующихся при участии ферментов, способен синтезироваться матричным путем. Создана генно-инженерная конструкция на основе бинарного вектора pCAMBIA 1305.1, несущего исследуемый ген под управлением вирусного конститутивного 35S промотора. Получены модельные трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum L.), в которых такая конструкция при экспрессии псевдофитохелатинового гена обуславливала дополнительную устойчивость к воздействию различных концентраций кадмия.

Ключевые слова: Nicotiana tabacum - трансгенные растения - фитохелатины - псевдофитохелатины -синтез гена de novo - кадмий - гипераккумуляторы - фиторемедиация - фитомайнинг

Одной из наиболее актуальных проблем нескольких последних десятилетий является неизбежно нарастающее техногенное загрязнение окружающей среды, в частности, тяжелыми металлами, в число которых входят ртуть, кадмий, свинец, цинк, медь и некоторые другие. Попадая различными путями в почву и присутствуя в ней в повышенных концентрациях, они поступают сначала в растения, а затем с продуктами питания и в организм человека и животных [1]. Загрязнение плодородного слоя почвы тяжелыми металлами представляет собой серьезную проблему, поскольку такие металлы, как цинк, свинец и особенно кадмий, обычно присутствуют в минеральных удобрениях [2]. Однако общепринятые технологии рекультивации земель требуют больших капиталовложений и могут сопровождаться возникновением нежелательных побочных эффектов. Более того, эти технологии разрушают структуру почвы и приводят к ее биологической инактивации [3-5]. Большинство этих методов нельзя использовать для очистки территорий, где плодородие почв имеет большое значение [6].

В связи с этим, для очистки и стабилизации загрязненных участков наиболее привлекательным выглядит применение растений, или так называемая "фиторемедиация" [7-9]. При этом стои-

Адрес для корреспонденции: Постригань Богдан Нилович. 450054 Уфа, проспект Октября, 71. Институт биохимии и генетики УНЦ РАН. Факс: 8 (347) 235-60-88; электронная почта: Postrigan@bk.ru

мость всего комплекса мероприятий по очистке снижается, а какой-либо дополнительный ущерб окружающей среде отсутствует. Фиторемедиация не только способствует удалению из почвы загрязнителей, но и препятствует процессу выщелачивания почв, что приводит к улучшению почв (или, по крайней мере, к сохранению их структуры), а именно, к повышению плодородия и сохранению возможности переработки загрязняющих веществ. Данный способ может использоваться для очистки больших территорий, где метод экскавации не приемлем, а также для очистки подземных и сточных вод. Однако на сильно загрязненных территориях он ограничивается устойчивостью самих растений, применяемых при очистке. Существуют естественные растения-аккумуляторы, которые могут накапливать тяжелые металлы в высоких концентрациях. Однако чаще всего они растут медленно и имеют низкую биомассу [10].

В последнее время разрабатываются различные подходы, обеспечивающие повышение эффективности фиторемедиационных мероприятий путем увеличения скорости роста и биомассы растений-гипераккумуляторов, в основном при помощи генно-инженерных приемов, таких как введение генов, кодирующих признаки, характерные для растений-гипераккумуляторов [11]. Одним из таких свойств является синтез различных металл-связывающих пептидов.

За связывание тяжелых металлов в растениях отвечают, помимо других механизмов, специальные пептиды — металлотионеины и фитохелати-

ны. Наибольший интерес представляют короткие, ферментативно синтезируемые, богатые ци-стеином пептиды — фитохелатины с общей структурой [y-Glu(Cys)]n-Gly, где n = 2-11 [12, 13]. Эти пептиды обладают рядом преимуществ, обусловленных их уникальными структурными характеристиками, основанными на непрерывно повторяющихся звеньях y-Glu-Cys. Кроме того, показано, что фитохелатины обладают более выраженными металл-связывающими способностями по сравнению с металл отионеинами [14]. При создании растений, пригодных для использования в фиторемедиации, видится перспективным использование синтетических "псевдофито-хелатиновых" генов, непосредственно кодирующих фитохелатины с несколько измененной структурой, характеризующейся отсутствием у-пептидной связи глутамина благодаря матричной природе их синтеза. Это становится возможным, поскольку в фитохелатинах основную нагрузку по связыванию тяжелых металлов выполняют мотивы y-Glu-Cys через комплексообразование. Таким образом, проведенный анализ литературы показал, что каких-либо серьезных препятствий для создания и функционирования в растениях таких генов и для существования самих псевдо-фитохелатинов с обобщенной формулой Met[(a-Glu(Cys)]n-Gly (где n - количество повторяющихся мотивов Glu-Cys) не имеется.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлся искусственно синтезированный псевдофитохелатиновый ген и созданная на его основе генно-инженерная конструкция в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1. Трансформацию компетентных клеток Escherichia coli генетической конструкцией, содержащей псевдофитохелатиновый ген, проводили "кальциевым методом". Электропорацию компетентных клеток Agrobacterium tumefaciens проводили с помощью Micropulser ("Bio-Rad", США). Плаз-мидную ДНК выделяли методом мягкого лизиса с некоторыми модификациями, заключавшимися в сильном уменьшении концентрации сахарозы в "суспендирующем" буфере и осаждении плаз-мидной ДНК из лизата, осветленного полиэти-ленгликолем.

Трансгенные растения создавали путем агро-бактериальной трансформации листовых пластинок табака (Nicotiana tabacum L.) сорта petit-SR1 модифицированным штаммом агробактерий AGL, содержащих генетическую конструкцию с псевдофитохелатиновым геном. Наличие псевдо-фитохелатинового гена в генетических конструкциях выявляли при помощи ПЦР с использованием праймеров pphF 5'-ATCCATGGAATGCGA-3', pphR 5'-CTTAGCCTTCGCACTC-3' и w/ogusU 5'-TTTCATTTGGAGAGAACACG-3' и w/ogusL 5'-

GCTGGTCACCAATTCACAC- 3', ограничивающих как сам псевдофитохелатиновый ген, так и прилегающую к нему область вектора pCAMBIA1305.1.

Выживаемость трансгенных растений проверяли, выращивая их листовые пластинки на среде МС с добавлением на 100 мл среды 40 мг Са02, 3 г сахарозы, 3 мМ морфолинэтансульфоновой кислоты (рН 5.7) и Cd2+ (в виде соли (CH3COO)2Cd) в концентрациях 100, 200, 300 и 400 мкМ.

Определение содержания кадмия в растениях.

Количественное определение кадмия в образцах растений после озоления и растворения золы азотной кислотой проводили атомно-абсорбци-онным методом с использованием спектрофотометра с плазменным атомизатором ААS-30 ("Carl Zeiss", Германия). Подробности методики были описаны нами в предыдущей публикации [15].

Одновременно с обработкой пробы проводили "холостой" опыт, заменяя анализируемую пробу водой. К 100 мл воды добавляли 6 мл азотной кислоты, перемешивали, кипятили в течение 20 мин. Далее фильтровали в колбочки на 100 мл и доводили до метки водой. Приготовленную пробу распыляли в пламени горелки, и снимали показания.

После пяти последовательных измерений анализируемых проб, распыляли один из стандартных растворов (с известной концентрацией кадмия) для контроля стабильности работы прибора. Если измеренная величина выходила за пределы концентрационного графика, то пробы разбавляли.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначально выбор пал на вариант псевдо-фитохелатина со следующей последовательностью аминокислот — Мet[(a-Glu(Cys)]n-Gly, и с учетом частот встречаемости тех или иных кодо-нов в растениях была воссоздана его нуклеотидная последовательность. Для конструирования и клонирования предполагаемого псевдофитохелатино-вого гена были синтезированы соответствующие комплементарные друг другу олигонуклеотидные блоки: Pph1 5'-ATCCATGGAATGCGAATGT-GAGTGCGAGTGCGAGTGCGAAGGCTAAG-3' и Pph2 5' - CTTAGCCTTCGCACTCGCACTCG-CACTCACATTCGCATTCCATGGAT- 3'. Посл е-довательности данных олигонуклеотидов были составлены с целью направленного клонирования в бинарном векторе pCAMBIA1305.1 по сайтам узнавания рестрикционных эндонуклеаз NcoI и PmlI соответственно.

Псевдофитохелатиновый ген был подготовлен к клонированию путем отжига двух олигонуклео-тидов друг с другом с ферментативным фосфори-лированием их 5'-концов. Наличие вставки полученного гена в векторе проверяли при помощи ПЦР (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-амплификации вставки псевдофитохелатинового гена в векторе 1305.1. 1 - маркер, амплификат с продуктов отжига олиго-нуклеотидных блоков, образующих псевдофитохела-тиновый ген; 2, 3 - амплификаты исследуемых клонов, содержащие вставку гена; 4 - клон, не содержащий вставки; 5 - отрицательный контроль.

12 3 4 [■ 5 6 7 8

Рис. 2. Электрофореграмма ОТ-ПЦР псевдофитохелатинового гена в трансгенных растениях табака. 1 — положительный контроль; 2—7 — продукты амплификации ОТ-ПЦР трансгенных растений; 8 — отрицательный контроль.

После подтверждения наличия целевой вставки, плазмидами из выбранных клонов были трансформированы агробактерии штамма ЛОЬ с последующей трансформацией листовых пластинок табака. Кроме того, наличие псевдофитохе-латинового гена, встроенного в геном растений, проверяли амплификацией с ДНК предположительно трансгенных и контрольных растений, а также постановкой ОТ-ПЦР с тотальной РНК трансгенных растений (рис. 2). Затем был проведен эксперимент по оценке экспрессии псевдо-фитохелатинового гена в растениях табака.

С этой целью использовали растения, выращенные из семян первого поколени

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎